粗糙鏈孢霉的分離和交換

【實驗目的】
1.用粗糙鏈孢霉的賴氨酸缺陷型和野生型進行雜交，并觀察雜交所得后代的子囊孢子的分離和交換現象。
2.掌握順序排列四分體的遺傳學分析方法，進行有關基因與著絲粒距離的計算和作圖，加深理解基因分離和連鎖交換規律。

【實驗原理】
粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa，2n＝14)，又稱紅色面包霉，在分類學上屬于真菌中的子囊菌綱、球殼目、脈孢菌屬，目前已知有4～5種。

利用粗糙鏈孢霉進行遺傳學分析有如下優點：①個體小，生長快，容易培養；②既可進行有性繁殖，又可進行無性繁殖，一次雜交可產生大量后代；③染色體與高等生物一樣，研究結果可廣泛應用于遺傳學上；④無性世代是單倍體，沒有顯隱性，基因型可以直接在表型上反映出來；⑤一次只需分析一個減數分裂的產物，就可以觀測倒遺傳結果，簡單易行，而二倍體合子是兩個不同減數分裂產生的配子相互結合的結果，需要通過測交實驗才能分析減數分裂的結果，手續麻煩。因此粗糙鏈孢霉是進行基因分離和連鎖交換遺傳分析的好材料。

粗糙鏈孢霉的營養體是由單倍體（n＝7）的多細胞菌絲體和分生孢子所組成，生活方式由有性和無性兩種。菌絲經有絲分裂直接發育成菌絲體，稱無性生殖。而兩種不同接合型細胞結合產生有性孢子的過程稱有性生殖。 無性繁殖過程，由菌絲頂端斷裂形成分生孢子。分生孢子有兩種，小型分生孢子中只含有一個核，大型分生孢子有幾個核。分生孢子萌發成菌絲，可以再生成分生孢子，周而復始（見下圖）。

粗糙鏈胞孢霉的生活史
1- 3 為無性繁殖；4-9 為有性繁殖。圖中間示基因交換發生位置及子囊 孢子的排列順序，（1）（2）為非交換型；(3)（4）（5）（6）為交換型。

在有性生殖過程中，粗糙鏈孢霉的菌株有兩種不同接合型(mating type)，它們受一對等位基因控制。不同接合型菌株的細胞接合產生子囊果及子囊孢子。

粗糙鏈孢霉的子囊孢子是單倍體細胞，由它發芽長成的菌絲體也是單倍體。所以由一對等位基因決定的性狀在F1就能分離。并且，它的一次減數分裂產物包含在一個子囊中，可以直接觀察到基因分離，并證明基因在染色體上。同時，再一次有絲分裂后，8個子囊孢子有順序地排列在子囊中，就可以測定著絲粒距離和發現基因轉變。

交換型子囊的出現，是由于核基因與著絲點之間發生了一次染色體片段的交換的結果，即由第一次分裂分離形成的子囊為非交換型子囊，第二次分裂分離形成的子囊為交換型子囊，因而第二次分裂分離的子囊數量愈多，表明有關基因和著絲粒的距離愈遠。根據第二次分裂分離子囊的頻數，就可以計算出某一基因和著絲粒間的距離，這距離稱為著絲粒距離。由于交換只發生在二價體的4條染色單體中的2條之間，當每發生一次交換時，便產生一個第二次分裂分離子囊，所以交換型子囊中僅有一半子囊孢子屬于重組類型，因此必須將第二次分裂分離子囊的百分率除以2，就是某一基因與著絲粒間的重組值，計算公式如下：

【實驗儀器、材料和試劑】
粗糙鏈孢霉野生型菌株(Lys+)，賴氨酸缺陷型菌株(Lys-)。

【方法與步驟】
一、菌種活化
進行雜交實驗前，要先把冷凍保存的菌種活化。把野生型和缺陷型菌種分別斜面接種到各自的試管培養基上，置于28℃恒溫培養箱中培養5—7天，直至菌絲上部有分生孢子產生，長好的菌株在菌絲上部可見紅粉狀孢子。保存和活化可用馬鈴薯培養基。

二、接種雜交
在無菌條件下，先將接種環挑取lys-菌株的菌絲或分生孢子，團塊直徑約3—6mm，接種于雜交培養基上，再挑取Lys+菌株的菌絲或分生孢子，團塊直徑約1—2mm，接種在同一雜交培養基上，讓其雜交。接種時，試管口應靠近火焰，以防污染，并貼上標簽，然后放在25℃恒溫培養箱中培養，約經14天左右，可看到棕黑色的成熟子囊，此時即可在顯微鏡下觀察分析。

觀察時要注意掌握好孢子的成熟程度，如過早，子囊中的孢子尚未成熟而呈白色，若偏遲，則孢子全為黑色，對交換型和非交換型孢子難于區別。要掌握適宜的觀察時期，最好是在子囊殼開始變黑時，每天取幾個子囊果壓片觀察，當看到適合時即置于4～5℃冰箱中，可保存3～4周，延長觀察時間。

三、壓片觀察
將附有子囊果的濾紙條放入3％來蘇爾溶液中處理10min，殺死孢子，以防孢子飛揚污染實驗室。取一載波片，滴一滴3％來蘇爾溶液，然后用接種針跳出子囊果放在載波片上，用鑷子柄平壓，或蓋上另一載波片，用手指壓片（這里用載波片蓋上壓片而不用蓋玻片，是因為子囊果很硬，蓋玻片易破裂），壓片時要適當用力壓破子囊果，使子囊呈放射狀逸出，但要注意不能讓分生孢子散出，一個子囊果中會散出30～40個子囊。壓片時最好一次一個子囊果，多了壓不好。

片子壓好后，置于100×顯微鏡下觀察，觀察時要順時針方向觀察，自中心向外確定子囊類型，計數并做好記錄。此過程不需無菌操作，但也要注意對觀察過的載玻片，用過的鑷子和解剖針等用具都需放入來蘇爾溶液中浸泡后取出洗凈，以免污染實驗室。