精準剖析：EAD／CID混合碎裂技術引領磷酸肽研究進入新維度

前言

酪蛋白是牛奶的重要組成部分和重要的營養來源，主要包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白4種酪蛋白。酪蛋白具有復雜的磷酸化等翻譯后修飾，如αs1-酪蛋白有9-10個磷酸化位點，αs2-酪蛋白有10-13個磷酸化位點，β-酪蛋白有5個磷酸化位點。酪蛋白的磷酸化修飾在酪蛋白膠束的形成以及與鈣和鋅等二價陽離子的相互作用和轉輸中起著重要的作用，這些功能可以促進營養物質在哺乳嬰兒腸道中的吸收。所以，對于牛奶中酪蛋白的磷酸化修飾的比例和位點的表征，可以準確和快速評價牛奶制品的產品質量屬性和批次一致性。

蛋白翻譯后修飾(PTMs)對于蛋白質的結構和生物學功能的具有決定性的作用。因為可通過對肽段的二級碎片離子譜圖的分析進行翻譯后修飾表征，質譜技術是目前被廣泛使用的用于PTMs表征的方法。ZenoTOF^? 7600系統上具備使用電子活化解離(EAD)和碰撞誘導解離(CID)兩種不同的碎裂模式產生用于磷酸肽進行表征的二級質譜信息 (圖1)。與單獨使用EAD或CID相比，使用混合EAD/CID碎裂技術可以提高酪蛋白肽段的序列覆蓋率，且經EAD/CID碎裂所產生的豐富的碎片離子能夠幫助準確識別酪蛋白的磷酸化修飾位點。

圖1. ZenoTOF 7600系統上混合EAD/CID碎裂技術的示意圖

使用ZenoTOF 7600系統

進行磷酸肽表征的主要特點

1. ZenoTOF 7600系統的Zeno^? trap（Zeno 阱）通過提高二級離子的占空比，顯著增強二級離子響應強度，確保低豐度的磷酸肽產生高質量的MS/MS圖譜；

2. EAD碎裂產生的c和z碎片離子，能夠準確確定磷酸化修飾位點；

3. EAD碎裂技術結合CID碎裂技術，即使是具有多個翻譯后修飾的長肽段也可以實現幾乎完整的序列覆蓋；

4. 翻譯后修飾的數據處理可以使用SCIEX OS軟件進行，并與其他處理軟件(如Skyline軟件、MSFragger和Peaks Studio等軟件)兼容。

實驗方法

樣品制備：

酪蛋白在低pH條件下從牛奶中利用沉淀法純化，用胰蛋白酶酶解除鹽以后得到肽段溶液。

液相色譜和質譜：

Waters M-Class液相色譜，色譜柱：ProteCol PEEKSIL C18G(3μm, 200 ?， 250 × 0.3 mm)，25min分離梯度。ZenoTOF 7600系統搭配OptiFlow Turbo V離子源。源參數設置：離子噴霧電壓5000 V，源氣溫度150℃，氣簾氣35 psi，gas1 20 psi，gas2 15 psi。

實驗結果

1. 使用EAD/CID混合碎裂可以生成碎片信息豐富的二級譜圖

ZenoTOF 7600系統既可以單獨進行EAD碎裂，也可以進行EAD和CID混合碎裂。EAD/CID混合碎裂能夠產生碎片信息更豐富的MS/MS圖譜，圖2顯示了β-酪蛋白中肽段FQSEEQQQTEDELQDK經過EAD/CID混合碎裂的二級譜圖。與EAD單獨碎裂相比，EAD/CID混合碎裂不僅能夠產生豐富的碎片離子確保肽段的MS/MS序列覆蓋，還能夠在低質量區域（紅色標識區域）產生更多樣化的碎片離子。

圖2. EAD/CID混合碎裂對β-酪蛋白肽段FQSEEQQQTEDELQDK二級譜圖的影響

2. 使用EAD/CID混合碎裂能夠增加長肽段的序列覆蓋率

EAD/CID混合碎裂能夠增加長肽段的序列覆蓋率，例如，αs1-酪蛋白中肽段

QFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEK含有42個氨基酸，包括4個脯氨酸殘基。使用EAD/CID混合碎裂可以顯著提升該肽段的序列覆蓋率（圖3）。b、c、y、z+1和z+2碎片離子基本能夠完整覆蓋該序列。

圖3. αs1-酪蛋白中肽段QFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEK的EAD/CID混合碎裂的MS/MS譜圖，以及CID碎裂與EAD/CID混合碎裂的序列覆蓋率比較

3. 使用EAD/CID混合碎裂能夠區分磷酸化位點和覆蓋多磷酸化肽段

EAD/CID混合碎裂能夠實現準確區分含有不同磷酸化位點的磷酸化肽段的同分異構體，如圖4所示，色譜分離顯示αs2-酪蛋白肽段NTMEHVSSSEESIISQETYK具有3個同分異構體。使用SCIEX OS軟件對質譜采集數據進行分析，在b、c、y、z、z+1和z+2碎片離子之間觀察到極好的碎片離子信息互補性，其中c、z+1和z+2碎片離子能夠幫助準確確認翻譯后修飾位點信息（如綠色標識區域）。

EAD/CID混合碎裂沒有觀察到攜帶不穩定修飾的片段離子的丟失，在αs1-酪蛋白的肽段QMEAESISSSEEIVPNSVEQK中也觀察到同樣的結果（圖5）。該段肽段由21個氨基酸（包括一個脯氨酸殘基）和5個磷酸化位點組成。盡管肽段結構復雜，但是通過EAD/CID混合碎裂仍然實現了100%的序列覆蓋，并且翻譯后修飾位點通過c和z+1碎片離子得到解析。

圖4. αs2 -酪蛋白多磷酸化肽段

NTMEHVSSSEESIISQETYK的XIC圖和MS/MS序列覆蓋

圖5. Αs-1酪蛋白多磷酸化肽QMEAES[Pho]IS[Pho]S[Pho]S[Pho]EEIVPNS[Pho]VEQK的MS/MS譜和序列覆蓋

總結

ZenoTOF 7600系統上的EAD碎裂或EAD/CID混合碎裂可用于復雜的肽段序列及翻譯后修飾分析；

EAD/CID混合碎裂可以產生碎片信息豐富的MS/MS譜圖，b、c、y、z、z+1和z+2碎片離子確保了序列覆蓋的完整性，同時保留翻譯后修飾位點信息；

在ZenoTOF 7600系統上， EAD/CID混合碎裂方法可以輕松地轉化為靶向多反應監測(MRM^??)方法，實現對酪蛋白中不同的磷酸肽異構體的定量和快速監測；

本實驗開發了一種檢測和表征酪蛋白中復雜磷酸肽的方法，這為未來開發基于質譜的此類蛋白定量方法提供參考。

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擴展閱讀

1. Potriquet, J., Pribil, P., Winter, D. (2023). Improving complex phosphopeptide characterization with hybrid EAD/CID MS/MS fragmentation, SCIEX TN: MKT-29611-A.