系統化生物芯片技術在功能基因組研究中的應用簡介

   二十一世紀高科技領域里最具時代特征的重大進展之一，就是生物芯片技術的發明和它的研究應用。1997年，生物芯片被全球商業界權威刊物美國《財富》雜志評為二十世紀科技史上影響深遠的兩件事之一[1]。生物芯片技術能夠對生物學問題進行量化和高通量的研究，這是以前的技術難以完成的。
 
    2000年，在我國有關專家的積極推動下，由清華大學、華中科技大學、中國醫學科學院和軍事醫學科學院共同出資組建成立了北京博奧生物芯片有限責任公司暨生物芯片北京國家工程研究中心，專門致力于生物芯片的研究、開發和產業化推動[2]。現在我國已經建立了包括北京國家芯片工程中心在內的五個生物芯片研發基地，即上海國家芯片工程中心、西安微檢驗工程中心、天津生物芯片公司和南京生物芯片重點實驗室[3]。
 
    2007年6月北京博奧生物芯片有限責任公司暨生物芯片北京國家工程研究中心的張亮博士在長春作了題為“系統化生物芯片技術在功能基因組研究中應用”的講座。張亮博士對生物芯片技術從原理、國際研究關注熱點、研究應用新進展等多個方面進行了介紹。下面內容以張亮博士講座內容為線索，進一步檢索、梳理、拓展而成。

    一、親和力生物芯片

    一般生物芯片亦即微陣列芯片，可以看成是大量生物傳感器構成的高密度、二維陣列。生物傳感器通過在傳感器表面固定生物探針分子，將分析物與探針分子相互作用后產生的信號，經過換能器轉換成可以計算機處理的數據信息。微陣列芯片得益于微加工技術，能夠在很小的面積上固定數目巨大的生物分子探針，因此可以高通量地進行生物分子相互作用的分析。絕大多數生物芯片分析都是基于生物分子間特異性相互作用進行的，例如基因芯片基于單鏈DNA鏈間的堿基互補配對結合進行分析（如圖1所示）；蛋白質芯片基于抗原－抗體特異性結合，蛋白質與小分子配體的特異性結合進行分析（如圖2所示）——這些芯片又可以稱為親和力生物芯片。

圖1 基因芯片

圖2 蛋白質芯片

二、MAQC計劃研究證明通過精確控制條件生物芯片具有可靠重現性

    生物芯片具有體積小而提供信息量大的優點。但是由于加工工藝及分析操作復雜，并且最初的研究沒有建立統一標準，不同實驗室，不同平臺甚至同一平臺而操作者不同所得到的實驗結果就會大相徑庭，導致人們對生物芯片分析結果重現性、可信性的懷疑。面對日益增多的質疑和爭論，美國食品和藥物管理局（FDA）領導實施了基因芯片質量控制（MAQC）計劃，對生物芯片檢測數據的重現性、可靠性進行了為期兩年的研究[4]。共有來自FDA、大學及Affymetrix等基因芯片公司和試劑生產廠商在內51個組織的137位科學家共同參與了這項研究工作。該研究結果詳細報道在2006年9月8日的Nature Biotechnology刊物上。題為“基因芯片質量控制計劃證明基因表達測量具有同平臺和平臺間的重現性”（The MicroArray Quality Control （MAQC）project shows inter- and intraplatform reproducibility of gene expression measurments）的報道對同一平臺數據重復性、可再現性，平臺間數據可比較性，相對精確性及不同平臺間相關性等方面進行了討論，得到如下結論[5]：生物芯片數據具有平臺內和平臺間的重現性，因此生物芯片技術可以用于基礎和應用研究甚至作為臨床診斷工具。當然，作為一個比較復雜的操作過程，生物芯片技術必須在精確控制的條件下進行，操作者的素質和水平直接影響著實驗結果的好壞。

 三、生物芯片技術研究應用點滴

    人類基因組計劃推動了各種生物基因組測序工作的進展，越來越多的生物全基因組序列被測定并公布，可是這才是解讀“天書”的開始。掌握了基因組序列，卻不知道基因序列背后所隱藏的秘密——即基因組的功能，就不能真正理解“天書”更談不上服務于人類。如何從海量的基因序列數據中發掘這些成千上萬基因的功能，研究基因在生命過程中所擔負的重要角色，成為基因組時代特別是后基因組時代面臨的重要課題，亦即功能基因組研究[6]。在這樣的背景下，生物芯片技術于20世紀90年代產生并迅速發展為席卷生物、生命科學、醫學等等研究、應用領域的一個熱點技術，對傳統生物分析方法起到了非常大的推動和變革作用。
 
    1、FDA批準上市荷蘭Agendia公司的MammaPrint基因表達譜芯片
 
    傳統生物分析實驗方法研究基因組功能的最大缺點是：孤立、片面研究單獨或少數基因在生命過程、疾病發生中的作用，忽視了基因間的相互影響和協同作用。這也是受傳統實驗方法本身特點所限，因為這些實驗往往步驟繁瑣而且一次只能完成少數分析。生物芯片技術具有高通量的特點，在一次芯片分析結果上就可能顯示出成百上千的基因的信息，而綜合、系統地考慮眾多數目的基因的變化是成功揭示基因組功能的關鍵。
 
    2007年2月，美國食品藥物管理局（FDA）批準了荷蘭Agendia公司的MammaPrint基因表達譜芯片。這是世界上首個被FDA批準上市的基因表達譜分子診斷芯片產品[7]。MammanPrint基因表達譜芯片是一種用于乳腺癌預后診斷的芯片產品，可以預測患者在首次發生癌癥的5到10年內乳腺癌復發的可能性[7]。一般乳腺癌通過手術切除治療后，對于預后效果好壞，是否需要進行化療或者使用哪種藥物治療等問題，通常只能依靠醫生參考一些指標作出經驗判斷，人為因素影響大。該基因表達譜芯片通過綜合分析病人的70個基因表達，能夠比較準確地預測病人的預后效果，以便醫生決定采取有針對性的治療方案[7]。
 
    2、生物芯片用于比較基因組雜交（CGH）研究
 
    比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）芯片通過檢測、比較樣品與對照樣品的基因組DNA的拷貝數量，可以直觀地得到基因組DNA發生變異的位點信息及拷貝數量變化信息。1998年，Pinkel等利用比較基因組雜交（CGH）微陣列芯片技術實現了基因組DNA拷貝數量變化的高靈敏度分析[8]。該工作發表在當年10月份的Nature Genetics上。基因組DNA片段的擴增或缺失在許多疾病的發生、發展過程中起到重要作用，例如，抑癌基因及原癌基因的缺失或過度表達引起了癌癥的發生[8]；另外，同一物種的不同亞型含有不同的基因表型。因此，比較基因組雜交芯片可以用于腫瘤等疾病的診斷，腫瘤遺傳學研究，以及對同一物種的不同亞型進行準確分型等等。比較基因組雜交芯片的檢測過程主要如下：將樣品及參照樣品基因組DNA進行處理，并標記上不同的熒光基團，混合均勻后與微陣列芯片上DNA探針進行雜交。基因組DNA拷貝數量即與雜交后芯片上樣品與參照樣品熒光強度比值有關，如果樣品的基因組DNA某序列下調，則該序列位置處樣品熒光要弱于參照樣品的熒光，反之則強于后者[8,9]。
 
    3、生物芯片用于單核苷酸多態性（SNP）研究
 
    人類基因組攜帶了重要的遺傳信息。基因組DNA中單個堿基的置換、缺失或插入是非常普遍的DNA多態現象，人類基因組序列在不同人種、人群和個體之間存在大約0.1%-0.2%的DNA序列差異，即單核苷多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）[10]。2005年，Altshuler等在Nature上發表了題為“人類基因組單體型圖”的工作（A haplotype map of human genome）[11]。在來自不同人群的269個DNA樣本中，研究者發現至少存在100萬種單核苷多態性（SNP）改變，并找到了人類基因組中很多熱點區（hotspot，即最易出現SNP的位置）。在熱點區基因組容易改變從而發生不同的演化，使人類逐漸進化，或者形成疾病及對疾病的易感性[11]。人類基因組單體型圖，特別是熱點區的單體型圖旨在揭示比較不同個體的單核苷多態性（SNP）分布，以了解個體差異的分子機制。由單核苷多態性（SNP）所引起的遺傳多態性與個體惟患疾病種類、程度及個體藥物代謝差異都有非常密切的關系。所以，檢測單核苷多態性，并且深入了解單核苷多態性等基因變異與疾病發生、發展，個體藥物代謝的關系，對于疾病的預測、預防、診斷，有針對性地使用特效藥物，合理設計治療策略以及預后治療等都有著重要意義[10,12]。用于單核苷多態性檢測的基因芯片可根據需要，固定覆蓋全基因組50萬個SNP的探針，將樣品基因組DNA酶切、擴增后進行熒光標記，并與芯片上的探針雜交，分析結果就可以得到單核苷多態性的分布及表達量[13]。

 4、利用生物芯片測定MicroRNA實現精確的腫瘤分子分型
 
    microRNA (miRNA)是一類長度很短的非編碼調控單鏈小分子RNA。它由基因組DNA編碼、通常長度約20～24個核苷。microRNA是由一段具有發夾環結構，長度為70～80個核苷的單鏈RNA前體（pre－miRNA）剪切后生成[14]。研究發現，microRNA與siRNA有相似之處，但也有很大不同。siRNA即小干擾RNA（small interfering RNAs）可以誘導與siRNA單鏈序列完全互補結合的靶mRNA被酶降解，從而抑制該基因的表達，即基因沉默[15]。siRNA是人工合成，外源性的能夠沉默特定基因的小分子RNA。而microRNA是哺乳動物細胞內廣泛存在的，能夠調節許多基因表達的小分子RNA[14]。microRNA主要通過降解mRNA和抑制翻譯兩種方式調控生物體內的基因表達，在動植物的生長發育、細胞的分化和凋亡以及人類疾病的發生（如腫瘤）等過程中發揮著重要的調控作用[14，16]。2005年，Lu等在Nature上發表題為“microRNA表達譜用于癌癥分類”(MicroRNA expression profiles classify human cancers)的報道[17]。研究人員系統分析了217個哺乳動物的microRNA，發現腫瘤細胞中各種microRNA的拷貝量與正常細胞相比普遍下調。利用microRNA表達譜，他們成功地對難以區分的腫瘤進行了準確分類，而利用mRNA表達譜則無法實現分類[17]。最近，Zhang等發表了題為“microRNA在腫瘤發生過程中作用”（MicroRNAs in Tumorigenesis：A Primer）的綜述[18]。文中指出microRNA的特殊功能與腫瘤發病機理密切相關，使其在腫瘤的分類和預測方面都具有重要價值。所以通過測定microRNA可以實現精確的腫瘤分子分型，以便掌握腫瘤個體差異,準確有效地用藥。由于動植物細胞內microRNA序列眾多，例如已知的人的成熟microRNA有近600個之多，小鼠、大鼠的成熟microRNA分別為350多個及230多個[16]。所以要系統考查如此數目眾多的microRNA的表達情況,必須借助高通量的實驗手段，基因芯片技術就是非常適合的方法。首先根據已知的microRNA序列設計制備合適的microRNA芯片，一般是含有幾百個RNA探針的陣列。分離樣品的低分子量RNA進行熒光素標記，然后和芯片上的探針雜交，獲取熒光信號，分析結果得到microRNA表達信息[16]。
 
    結語
 
    生物芯片技術的出現給傳統生物分析研究帶來了巨大變革。經典分子生物學往往研究個別基因的作用。隨著人類基因組計劃的完成，龐大的基因組DNA序列被揭示，但是基因組相關的很多功能仍是未解之迷。要從海量的基因序列數據中發掘這些成千上萬基因的功能，研究基因在生命過程中所擔負的重要角色——亦即功能基因組研究，依靠經典分子生物學等傳統的生物分析方法已經遠遠不能滿足要求。生物芯片技術具有高通量的特點，對于需要同時、系統分析很多基因的功能基因組的研究是非常有力的工具。

    參考文獻 

[1]http://money.cnn.com/magazines/fortune/fortune_archive/1997/03/31/224035/index.htm

[2]http://most.gov.cn/ztzl/jqzzcx/zzcxcxzzo/zzcxcxcg/zzcxgncxcg/200505/t20050513_21537.htm

[3]  http://www.istis.sh.cn/hykjqb/wenzhang/list_n.asp?id=1634&sid=2 

[4]  http://www.fda.gov/nctr/science/centers/toxicoinformatics/maqc/ 

[5]  MAQC  Consortium，The  MicroArray  Quality  Control  （MAQC）project  shows  inter-and  intraplatform  reproducibility  of  gene  expression  measurments，Nature  Biotechnology，2006，24,  1151－1161  

[6]  陳竺，李偉，俞曼，熊慧，陳賽娟，人類基因組計劃的機遇和挑戰：1從結構基因組學到功能基因組學，《生命的化學》1998年18卷5期，5－13頁

[7]  http://www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/2007/NEW01555.html 

[8]  Pinkel  D  et  al,  High  resolution  analysis  of  DNA  copy  number  variation  using  comparative  genomic  hybridization  to  microarrays，Nature  Genetics，1998，20，207-211 

[9]  http://www.capitalbio.com/Exhibit/exhview1.asp?pid=223

[10]  http://genetics.gsk.com/link.htm 

[11]  Altshuler  D,  Brooks  LD,  Chakravarti  A,  Collins  FS,  Daly  MJ,  Donnelly  P,  A  haplotype  map  of  the  human  genome，Nature，2005，437，1299－1320 

[12]  http://genetics.gsk.com/determin.htm#SNPs 

[13]  http://www.capitalbio.com/Exhibit/exhview1.asp?pid=222 

[14]  華友佳，肖華勝，microRNA研究進展，《生命科學》2005年17卷3期，278－281頁 

[15]  http://www.bioon.com/experiment/rna6/62935.shtml 

[16]  http://www.capitalbio.com/Exhibit/exhview1.asp?pid=242 

[17]  Lu  J  et  al，MicroRNA  expression  profiles  classify  human  cancers，Nature，2005，435，834－838 

[18]  Zhang  WY，Dahlberg  JE，Tam  W，MicroRNAs  in  Tumorigenesis：A  Primer，American  Journal  of  Pathology，2007，171，728－738