關鍵詞： 血細胞；保存；冰凍干燥 中圖分類號 R318.52 R331.1＋41 成分血的輸注在發達國家已占血液輸注的90%以上，因此紅細胞的保存研究倍受重視。血細胞的保存通常是在4℃條件下進行，保存時間可以有效地延續至42d。特殊情況下實行深低溫保存，放在－80℃冰箱或液氮(－196℃)中長期保存［1］。這兩種方法都需要低溫設備，在進一步改進保存技術的研究中，冰凍干燥紅細胞已成為細胞保存研究的新策略，引起了人們的關注。現將以此為主要內容的研究作一簡要文獻回顧。 1 血液輸注和保存研究的發展史(表1)
表1 輸血及血液保存研究的簡史
| 年份 | 事跡 |
| 1898 | 首次將血液用于婦科病人 |
| 1900 | 發現紅細胞ABO血型，并用于臨床 |
| 1947 | 用ACD保養液保存全血21d |
| 1957 | 用CPD保養液保存全血28d |
| 1978 | 用CPDA-1保養液保存全血35d |
| 1980 | 用MAP保存液保存全血42d |
| 1989 | 冰凍干燥保存紅細胞 |
| 1995 | 凍干紅細胞再水化后進行人體實驗 |
| 1996 | 深低溫(－196℃和－80℃)保存紅細胞28年［1］ |
| 1997 | 申報紅細胞和血小板凍干ZL累積15項 |
2 紅細胞冰凍干燥保存的可行性 4℃和深低溫條件下保存紅細胞經長期實踐獲得了良好效果，已經得到確認，但冰凍再加上干燥保存之后，特別是細胞能否經受得住干燥給細胞帶來的損傷，再加上早期嘗試凍干保存血細胞的失敗的經歷，容易使人們感到困惑。Goodrich［2］于1989年取得了突破性進展，用分子量為2.4萬，180g/L濃度的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、單糖和聚陰離子化合物等制備的填加液凍干保存紅細胞，使經凍干后再水化的紅細胞存活率為凍干前的72.1%，血紅蛋白的回收率為66.9%，初步顯示了凍干紅細胞的可行性。1992年，提高了人工凍干添加液中PVP的濃度(20%)，再加1 mol濃度的蔗糖，使紅細胞的活存率增加到77%，Hb的回收率為76.4%［3，4］。1993年，用分子量4萬的PVP和適宜的單糖等組成的添加液凍干保存細胞壓積為10%的紅細胞懸液，再水化后，反映紅細胞攜氧功能的P50為26～28mmHg，氧合Hb為正常紅細胞的90%以上，同年Sowemimo-Coker等［5］采集人靜脈血紅細胞，CPDA-1抗凝，取部分紅細胞放在4℃條件下保存7d和14d，作為對照;其余用等滲葡萄糖鹽水和凍干緩沖液(cryopharmpasadena,CA)混均，用凍干機(Model 115 SRC,Virtis Co.)凍干,－20℃保存7d，用磷酸鹽緩沖液-葡萄糖鹽水(pH 7.4,298 m0smo/kg)再水化，自動細胞洗滌機(Model 2991,Cobe)按標準洗滌程序洗滌后分成4組：第1組供測定各項指標用,第2～4組分別用ADSOL，CPDA-1和特殊添加劑混均，繼續4℃保存7d，在前7d末和后7d末，測定紅細胞ATP含量和反映紅細胞攜氧能力的2，3-DPG等指標。結果發現，保存后凍干組和4℃保存CPDA-1組的相應指標與對照組相近，甚至更好，詳見表2。 表2 人紅細胞凍干保存7d(－20℃)和再水化后4℃ 保存7d紅細胞各項指標的變化
| 測定指標 | 凍干保存＋再 水化* | 凍干＋再水化 4℃保存** | P |
| ATP(μmol/g Hb) | 4.39±0.55 (4.02±0.45) | 3.37±1.99 (3.53±0.40) | NS* |
| 2，3-DPG（μmol/g Hb） | 4.94±2.85 (3.14±2.02) | 0.40±0.49 (0.70±0.73) | NS |
| 乳酸鹽(μmol/gHb) | 3.9±1.4 (45.9±1.5) | 17.9±13.6 (83.9±9.7) | ＜0.001 |
| MCV(fl)-細胞容量 | 90.8±4.4 (93.5±4.41) | 90.3±4.9 (95.3±4.7) | NS ＜0.02** |
| MCH(pg)-平均細胞Hb | 29.9±1.6 (31.0±1.8) | 31.3±2.2 (31.3±1.6) | NS |
| 滲透性脆性(mOsmol/kg) | 156.7±2.07 (156.7±3.27) | 155.0±5.0 (160.2±11.1) | NS |
| 氧合Hb(%) | 97.4±1.8 (99.1±0.8) | 99.5±0.6 (99.8±0.3) | NS |
| Hb(%) | 未檢測 | 99.2±0.3 (99.1±0.8) | NS |
| Dimax-最大形變指數 | 0.64±0.02 (0.69±0.09) | 0.61±0.03 (0.63 0.02) | NS ＜0.007** |
| 相對濾過指數 | 0.70±0.16 (0.92±0.09) | 0.86±0.08 (0.99±0.02) | ＜0.02 NS** |
注：( )括弧內數字為對照值；兩項指標凍干保存與對照組相比結果；**凍干＋4℃保存與對照組相比結果；NS實驗組與對照組比較無顯著性意義 1995年Weinstein等［6］報道的凍干紅細胞人體輸注實驗，向該項研究的最終目標——臨床應用邁近了一步。從4名健康(21～35歲）志愿受試者采集1U(400ml)靜脈血，4℃存放過夜，再行冰凍干燥保存。給獻血者回輸的當天，將凍干紅細胞再水化，用放射性同位素51Cr標記紅細胞后，取20ml，5min輸完。結果表明，凍干血紅細胞回輸后未見臨床不良反應，體內實驗，24h紅細胞回收率為(85.2±2.79)%，紅細胞半壽期為31.0±8.19d(正常值為25～33d)；體外檢測，用流式細胞儀檢測凍干前后細胞計數并計算其細胞回收率%，氧合血紅蛋白，P50，紅細胞滲透性脆性，變形性，ATP，2，3-DPG等見表3［6，7］。 表3 人凍干紅細胞的體外和整體實驗各項指標的變化
| 指標 | 新鮮紅細胞 | 凍干再水化紅細胞 |
| 紅細胞活存率(%) | 100 | 85.2±2.79 |
| ATP(μmol/gHb) | 3.06±0.87 | 2.74±0.81 |
| 2,3-DPG（μmol/gHb) | 13.07±1.64 | 9.83±2.62 |
| P50(mmHg) | 27.88±1.18 | 27.25±1.84 |
| MCV(10－15L) | 88.10±2.44 | 90.93±2.56 |
| MCH(10－12G) | 30.73±1.88 | 29.98±0.88 |
| 氧合Hb(%) | 98.99±1.46 | 98.58±1.46 |
| 滲透性脆性(%) | 2.23±1.1 | 2.8±0.93 |
| 濾過指數 | 0.980±0.04 | 0.95±0.06 |
| 乳酸鹽(μmol/gHb) | 0.97±0.19 | 0.86±0.29 |
| 循環血中24h細胞活存率 | 89.925±4.129 | |
| 循環血中細胞半壽期 | 31±8.19 |
注：體內紅細胞24h活存率大于75%，保存的血液符合標準 綜合上述研究結果，得到的初步結論是，凍干紅細胞再水化后能夠重建生物學功能，整體回輸后能夠維持輸注正常血細胞一樣的存活率和循環時間。推測凍干人紅細胞可以在常溫下保存5年。 3 凍干保存人紅細胞的關鍵技術環節 3.1 凍干穩定劑的選擇 為了減少細胞損傷，在凍干液和再水化洗滌液中需要加入穩定劑(凍干緩沖液、洗滌液中的大分子聚合物和碳水化合物)，紅細胞凍干穩定劑文獻報道各異，主要包括：①大分子聚合物，如PVP、葡聚糖、羥乙基淀粉、骨膠等；②聚陰離子化合物，如焦磷酸、磷酸化肌醇；③碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖等；④磷酸鹽緩沖液或鉀、鈉等金屬離子［8～11］。其中大分子聚合物和聚陰離子化合物的選擇及其分子量和在溶液中的濃度等因素，對細胞的回收率均有影響。進一步的研究證明，PVP的玻璃化轉變溫度受分子量和濃度的制約，即玻璃化轉變溫度隨分子的增大而提高，隨著水分的丟失(或在凍干體系中濃度的增加)而提高，凍干和保存生物樣品應在保護劑的玻璃化轉變溫度下進行，以減少生物活性的丟失。Speiles等［12］在分析了多種保養液成分之后認為，依據玻璃化轉變溫度，選擇大分子聚合物是適宜的，比如骨膠(gelatin)和PVP等，因為它們可以在相對高的溫度下進行冰凍干燥，并可以縮短干燥時間。同時還發現，如保養液中加入鹽(氯化鈉)，將會隨著鹽濃度的增加減少PVP的玻璃轉變溫度的升高，因此認為應控制氯化鈉的加入量。 3.2 再水化過程中使細胞膜不受損傷 為了細胞的存活，凍干過程中細胞必須處于高滲狀態，所用保養液的滲透壓相當于3～5倍生理滲透壓，在給人體輸注前需要經過逐步洗滌。將細胞懸液的滲透壓調整到生理水平的過程中，容易出現細胞膜破裂，血紅蛋白流出的現象。其洗滌液的配制需要深入研究，有些文獻報道對此保密。 3.3 凍干過程中的溫度控制 紅細胞的凍干首先使細胞冰凍，由液態變成固態，然后使箱體內的細胞在抽氣減壓、升溫的同時，水分升華，逐步達到干燥的目的。因此，冰凍、升溫與真空度三者關系如何協調、控制，對凍干效果至關重要。Rindler［13，14］用20個樣品進行實驗，比較了－5℃～－65℃不同溫度下干燥人紅細胞的效果，凍干后紅細胞溶解率在－35℃時溶血率最低，效果最好。也有學者實驗結果顯示－93℃時優于－75℃和－66℃，溶血率卻均在19%以上，但凍干例數少，缺乏說服力［15］。 4 研究凍干保存紅細胞的重要意義
除了民用外，在以往的戰爭中也主要用4℃保存血輸注。海灣戰爭中美軍用的是－80℃冰凍血，使用前融化至零上溫度。使用液態血液有許多不便：如運輸困難、受氣溫限制較大、浪費較多(越南戰爭時期，美國1968～1972年統計，每年供血量浪費率高達60％～65%)、輸血反應多等。和4℃保存血相比，冰凍干燥紅細胞最大優勢是使血液由液態變成固態(粉劑)，是一種全新的存在形式，便于運輸，不需要專門運輸車；少受天寒酷暑影響；不存在因運輸震蕩溶血問題；便于長期保存；戰地醫院一時用不完的凍干血，可以留下來以后再用，減少浪費，總之可極大改善戰時血液供應狀況。因此，對傷員的救治，減少戰斗減少員，提高部隊戰斗力具有重要意義。此外，凍干粉劑紅細胞還可民用，對特殊災害時的醫療救治也能發揮巨大作用。
參考文獻
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13，Rindler V,Leberger S,Schwindke P,et al.Freeze-drying of red blood cells at ultra-low temperature.Cryobiology， 1999,38:2
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