納米孔直接RNA和cDNA長讀長測序概述

　　RNA測序已經在生物學和醫學的各個領域取得了前所未有的發展。在包括癌癥在內的諸多疾病中，轉錄異構體的表達和用途是健康組織和患病組織之間變異的重要來源。鑒定差異剪接的異構體和融合轉錄本，可以為疾病的診斷和治療提供信息。RNA測序還有助于揭示從單細胞到整個組織的轉錄組動力學。同時，cDNA測序也極大地輔助了病毒性病原體的表征和及時檢測。

　　毫無疑問，傳統的測序技術使全面轉錄組分析成為可能，并帶來了很多重要的科學發展。然而，這一領域仍有重要的局限性有待解決。

　　轉錄本的長度通常為幾千堿基對，這使得現有的短讀長序列僅能部分覆蓋轉錄本的長度，因此依賴計算重構準確的異構體組裝非常困難，短讀長也表現出高比率的多重定位。

　　基于測序的RNA分析均需要將 RNA轉化為互補DNA（cDNA）鏈，在這一過程中，逆轉錄或擴增可引入偏倚，產生GC偏好性。由于并非所有的轉錄物都以相同的效率擴增，會導致一些種類的RNA的中斷以及其它種類RNA的過度擴增。重要的是，在PCR 擴增過程中會丟失有關堿基修飾的所有信息。

　　隨著長讀長測序技術的發展，越來越多的國內外科學家將目光轉向了由英國Oxford Nanopore公司開發的納米孔測序技術。與其它基于光學原理的合成測序法不同，納米孔測序是通過將蛋白質納米孔嵌入電阻膜，并使離子電流通過納米孔。當像DNA或RNA這樣的分子穿過納米孔時，會對電流帶來干擾。該信號會被實時分析，用來確定正在通過納米孔的DNA或RNA鏈的堿基序列。

　　納米孔技術是唯一可以進行直接DNA與RNA測序的技術，當前最長讀長已達2Mb 【1, 可在文末掃描二維碼下載文獻】。此外，與在測序運行完成后開始數據分析的傳統測序方法不同，納米孔測序實時運行，可在測序進行中對讀長進行堿基識別和分析，從而顯著縮短從拿到樣本到出檢測結果的時間。一旦生成了足夠的數據，例如達到覆蓋度目標，可以立即停止運行。

　　在這里，我們將介紹和回顧幾篇發表的文章，討論應用納米孔技術進行全長轉錄本識別、異構體表達和定量、以及病毒檢測。

　　Nanopore長讀長RNA測序揭示個體B細胞表面受體之間廣泛的轉錄變異

　　早在2017年，由Byrne等人發表于《自然通訊》的一篇文章中【2】，作者研究了使用長讀長單分子Oxford Nanopore MinION測序儀的RNA測序是否能夠在不犧牲準確的基因表達定量的情況下，鑒定和定量復雜的異構體。

　　在對方法進行基準測試后，Byrne等人使用定制的混樣建庫策略分析了單個小鼠B1a細胞。作者在這些B1a細胞中鑒定了數千個未注釋的轉錄起始和終點位點，以及數百個可選擇的剪接事件。同時還鑒定了在B1a細胞中表達的數百種基因，這些基因顯示出多種復雜的異構體，包括幾種B細胞特異性表面受體。

　　Byene表示，他們的數據結果可以在單細胞水平上識別和量化復雜的異構體。使用Oxford Nanopore Technologies MinION測序儀的RNA測序研究有可能重新定義單個RNA測序實驗收集的信息水平。作者表示：“納米孔RNA測序在單細胞水平上測序全長轉錄本的能力真正突出并證實了IGH基因座的特殊轉錄多樣性”。

　　使用納米孔直接RNA測序解讀16S核糖體RNA中的經典和修飾的核苷酸

　　在另一篇Smith等人（2017）文章中，作者使用納米孔直接RNA測序對16S核糖體RNA中的經典和修飾的核苷酸進行了解析【3】。

　　核糖體小亞基在所有活細胞中表達。它在翻譯過程中發揮了許多基本功能，包括起始復合物的形成和mRNA密碼子與tRNA反密碼子之間堿基對的校對。小核糖體亞基的核心成分是原核生物中~1.5kb的 RNA鏈（16S rRNA）和真核生物中的同源~1.8kb RNA鏈（18S rRNA）。

　　傳統的rRNA基因或rRNA cDNA拷貝的合成測序（SBS）已廣泛用于系統發育研究和臨床鑒定傳染性生物。然而，通過SBS的方法移除了rRNA的表觀遺傳修飾信息。納米孔測序的一個顯著優勢，是可對天然DNA和RNA進行直接分析可以解析堿基修飾。

　　Smith等人利用納米孔MinION測序儀，直接對單個全長16S rRNA進行了無逆轉錄或擴增的測序。作者在文章中提出并回答了三個問題：

　　1）堿基修飾是否會引起離子電流改變？

　　是 – 改造后的菌株呈現“有能力”和“無能力”顯示特定的甲基化特征。有能力的菌株顯示出一致的可再現的堿基識別誤差，無能力的菌株識別正確。偏離規范模式的納米孔離子電流軌跡揭示了保守的16S rRNA堿基修飾，以及引起氨基糖苷類對一部分病理性大腸桿菌菌株產生抗性的7-甲基鳥苷修飾。這種直接RNA測序技術有望快速鑒定環境和患者樣本中的微生物。

　　2）分類的精度是否會隨讀長長度增加？

　　是  -分類準確度隨測序長度從短讀長（200-600bp）的67.9％增加到長讀長（> 1000bp）的96.9％。讀長更長=更好的分類準確性（如下圖所示）。

　　3）是否能夠從人類總RNA背景中選擇性地測序16S rRNA？

　　是  -成功在4.5微克的總人RNA中檢測到了少至5皮克（~10阿托摩爾）的大腸桿菌16S rRNA。表明可在2小時內從復雜的臨床或環境樣本中檢測到微生物16S rRNA。

　　對編碼完整甲型流感病毒基因組的直接RNA測序

　　傳統的RNA測序方法，RNA通常通過將其逆轉錄為cDNA進行間接測序，cDNA通常通過PCR擴增為dsDNA，然后使用多種DNA測序方法進行分析。

　　Keller等人(2018)使用納米孔技術，首次以其天然形式對編碼完整的RNA病毒基因組進行了測序【4】。作者針對甲型流感病毒基因組的高度保守末端設計了一種接頭，使用這種修飾的將（-）RNA靶向Oxford Nanopore MinION測序平臺上的蛋白質納米孔。作者證明了對編碼完整甲型流感病毒基因組的成功測序，具有100％核苷酸覆蓋率，99％共識一致性，99％的讀長定位到甲型流感病毒。該方法還具有識別和量化剪接變體和堿基修飾的潛力，而這些變體和堿基修飾實際上在使用當前其它方法中是無法測量的。

（A）甲型流感病毒在3'和5'末端含有高度保守的12和13個核苷酸序列。（B）Oxford Nanopore直接RNA測序的關鍵組分是逆轉錄酶接頭（RTA），其標靶poly（A）mRNA并連接到mRNA的3'末端。然后將測序接頭連接到RTA，RTA將RNA鏈導入孔中用于測序。（C）修改RTA以標靶甲型流感病毒基因組的3'保守12nt。（D）修飾的RTA在直接RNA測序的第一步中與vRNA雜交并連接。

　　納米孔直接RNA測序揭示全長冠狀病毒基因組的修飾

　　Viehweger等人（2018）使用全長、直接RNA測序方法，不經過任何擴增步驟，來表征感染人類冠狀病毒的細胞中產生的病毒RNA 【5】，所述人類冠狀病毒代表迄今已知的最大RNA病毒基因組之一。

　　使用來自感染冠狀病毒的細胞的總RNA，在便攜式測序儀MinION的兩張芯片上進行了直接RNA測序，獲得最長讀長為26 kb（基因中大小為27.3 kb）并成功比對到病毒參考基因組，冠狀病毒基因組覆蓋率達到99.86％。使用不需要組裝步驟的長讀長，作者在受感染的細胞中鑒定出仍有待表征的多種新型HCoV-229E sg RNA。由于該方法不需要RNA的逆轉錄和擴增，作者能夠檢測病毒RNA中的甲基化位點。我們的工作通過證明樣品內單倍型分離的可行性，為基于單倍型的病毒準種分析鋪平了道路。

　　在后續的文章中，我們將介紹目前對納米孔RNA和cDNA測序的系統性評估的研究。

1.使用Oxford Nanopore的cDNA測序指南:https://nanoporetech.com/cn/resource-centre/guide-cdna-sequencing-oxford-nanopore-cn[訪問時間2019年3月1日]

2. Byrne etal., Jul 2017, Nature Communications, Nanopore long-read RNAseq reveals widespread transcriptional variationamong the surface receptors of individual B cells. https://doi.org/10.1038/ncomms16027

3. Smith etal. 2017. BioRxiv, Reading canonical and modified nucleotides in 16Sribosomal RNA using nanopore direct RNA sequencing. https://doi.org/10.1101/132274

4. Keller etal., Sep 2018, Scientific Reports, DirectRNA Sequencing of the Coding Complete Influenza A Virus Genome. https://doi.org/10.1038/s41598-018-32615-8

5. Viehweger etal., 2018, BioRxiv, Nanopore directRNA sequencing reveals modification in full-length coronavirus genomes. https://doi.org/10.1101/483693

6. 納米孔測序白皮書: 無偏倚全長轉錄本的價值。訪問時間2019年3月1日。鏈接:https://nanoporetech.com/cn/resource-centre/wupianyiquanzhangzhuanlubendejiazhi