組建CRISPRCas9庫，讓標記DNA和靶向切割更精準

　　CRISPR-Cas9系統，被稱為第三代基因編輯技術。自3年前發明這一技術以來，由于它能夠很容易地結合并切割非常特異的DNA序列、失活基因，CRISPR-Cas9如暴風般橫掃基因組學領域。這為靶向基因療法治愈遺傳疾病，及發現疾病的病因帶來了巨大的希望。

　　相比于它的兩位前輩ZFN系統和TALEN系統，它有著一些無可比擬的優點。

　　首先，CRISPR-Cas9系統的可用位置更多。理論上基因組中每8個堿基就能找到一個可以用CRISPR-Cas9進行編輯的位置，可以說這一技術能對任一基因進行操作，而TALEN和ZFN系統則在數百甚至上千個堿基中才能找到一個可用位點，這大大限制了使用范圍。

　　其次，CRISPR-Cas9系統更具有可拓展性，例如可以通過對Cas9蛋白的修飾，讓它不切斷DNA雙鏈，而只是切開單鏈，這樣可以大大降低切開雙鏈后帶來的非同源末端連接造成的染色體變異風險。此外還可以將Cas9蛋白連接其他功能蛋白，來在特定DNA序列上研究這些蛋白對細胞的影響。

　　第三，更為重要的是，CRISPR-Cas9系統的使用極為方便，只需要簡單的幾步就能完成，幾乎任何實驗室都可以開展工作，而不需要向ZFN和TALEN那樣借助商業公司的協助完成。

　　由于以上特點，CRISPR-Cas9被評為2013年生物學10大突破之一。

　　來自加州大學伯克利分校的研究人員發現了一種更廉價及簡單的方法即通過編輯相關的函數組建CRISPR-Cas9庫，讓熱門的基因編輯工具CRISPR-Cas9靶向切割或是標記DNA。此外，還可以調整這一技術，借助于一種熒光標記結合及標記DNA，使得研究人員能夠定位和追蹤正在分裂的活體細胞細胞核中成千上萬基因其中的某一基因。

　　7月23日發表在《發育細胞》（Developmental Cell）雜志上的一篇文章詳細描述了這一稱作為CRISPR-EATING的過程：新開發的技術現在使得構建出讓CRISPR-Cas9精確靶向DNA的向導RNA變得更加的容易。確切來說，所需材料的成本不到100美元，任何人都可以生成成千上萬、覆蓋生物體整個基因組的精確引導探針。

　　在原理論證研究中，研究人員將常見腸道細菌――大腸桿菌的整個基因組變成了覆蓋88%細菌基因組的包含4萬個向導RNAs的文庫。每個向導RNA都是一個長20個RNA堿基對的片段：CRISPR-Cas9利用它作為模板來找出互補DNA結合并進行切割，首先需要將成千上萬的探針各自導入培養板上數十萬細胞的單個細胞中，構建的文庫可用于傳統的CRISPR-Cas9系統編輯靶向基因組中任何特定的DNA序列并切割它。

　　當研究人員試圖闡明某一基因的功能時就可通過敲除這一基因，看看細胞中會發生什么不好的事情，可助力確定疾病的原因。論文的第一作者、加州大學伯克利分校博士后研究人員Andrew Lane說：“我們可以花更少的錢來生成這樣的向導RNA庫，使得有可能可以在較少研究的生物體中進行遺傳篩查。”

　　實時監測細胞

　　加州大學伯克利分校博士后研究人員Andrew Lane和同事、加州大學伯克利分校的分子和細胞生物學教授Rebecca Heald開發出這一技術旨在實時追蹤活細胞中尤其是有絲分裂過程中的染色體。

　　此外該課題是Rebecca Heald教授主持的一個大型研究項目的組成部分，旨在闡明當生物體從幾個細胞生長為具有許多細胞時，是什么控制了細胞核和其他亞細胞元件的大小。他表示，這一技術將使得我們能夠給整條染色體涂上顏色，我們可以實時觀測它，在細胞周期過程中在細胞核內追蹤它，或當它經歷發育轉變例如在胚胎中時，看看它的大小和結構如何發生改變。

　　這一新技術利用了標準PCR來生成來自研究人員感興趣的任何DNA片段，甚至來自整個基因組的大量短DNA。隨后在稱作PAM的區域中精確剪下這些片段――PAM對于CRISPR結合至關重要。通過利用限制性內切酶切割離PAM端20個堿基對的片段，就生成了CRISPR利用來在基因組中搜查互補位點的精確大小的向導RNA，這些向導RNAs可以很容易地整合到CRISPR-Cas9復合物中，生成成千上萬可標記或切割DNA的探針。

　　加州大學伯克利分校創新基因組計劃管理和科學主任Jacob Corn 說：“通過利用基因組自身來作為向導RNA的來源，他們的方法使得幾乎所有實驗室都能構建出靶向連續區域的文庫。這對于基因組成像和某些類型的篩查可能非常有用。”