組織切片的免疫熒光標記實驗

組織樣品

PBS抗體

玻片加濕盒

1.  將濕紙巾鋪于載玻片盒底部做成加濕盒，由冰凍切片儀中取出載有切片的載玻片，放入玻片盒中（每邊放6片），或故濕盒中（載玻片勿相互接觸）。

2.  待載玻片達室濕且未干時，鋪加PBS于切片上（勿溢出玻片）。

3.  稀釋的第一杭體于4℃用微量離心機以13 500 g 離心2 min（每一載玻片上加40~50 ul 抗體，應能蓋住切片）。

4.  用與泵相連的巴斯德吸管，在切片的一端吸去玻片上的PBS，并從另一端加上抗體，蓋上加濕盒，室溫溫育1 h。

5.  以PBS冼玻片3次（5 min/次），從切片一端加入新的PBS緩沖液，由另一端吸去舊的緩沖液。

6.  稀釋的第二抗體于4℃用微量離心機以13 500 g 離心2 min（每載玻片可加40~50 ul 抗體）。

7.  將第二抗體加于切片上，置加濕盒中室溫溫育1 h，以PBS洗玻片3次（5 min/次）。
 

圖一、免疫組化標記的各種方法
 

8.  將蓋玻片放于紙巾上，滴加1滴Gelvatol 于蓋玻片中央。翻過載玻片放于蓋玻片上（勿施壓），將玻片置工作臺上，用鋁箔覆蓋避光放置30 min，使Gelvatol 凝結。
 

9.  顯微鏡下觀察結果，或置玻片盒中貯于4℃。

1、熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，可能會使熒光提前衰退。

2、每次試驗均需設置以下三種對照：

（1） 陽性對照：陽性血清+熒光標記物;

（2） 陰性對照：陰性血清+熒光標記物;

（3） 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物。

免疫熒光技術中標本制作的基本程序近似于酶免疫組化，不同點如下：

1、免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其相同。

2、免疫熒光的二抗使用不同熒光標記的二抗孵育，孵育時間根據抗體的工作濃度確定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。

4、免疫熒光在封片時常使用專用封片劑或甘油：0.01M PBS （1：1）。條件許可，建議購買抗淬滅的封片液，使標本可以保存更久。

5、熒光抗體的孵育以及后續處理需要避光。

6、熒光抗體染色假陽性可能會多，需要分別設定陽性和陰性對照。