①根據配方要求，用量筒或移液管從每種母液中分別取出所需的用量，放入同一燒杯中，并用粗天平稱取蔗糖、瓊脂放在一邊備用。
②將①中稱好的瓊脂加蒸餾水300～400毫升，加熱并不斷攪拌，直至煮沸溶解呈透明狀，再停止加熱。③將①中所取的各種物質（包括蔗糖），加入煮好的瓊脂中，再加水至1000毫升，攪拌均勻，配成培養基。
④用1N的氫氧化鈉或鹽酸，滴入③中的培養基里，每次只滴幾滴，滴后攪拌均勻，并用pH試紙測其pH值，直到將培養基的pH值調到5.8。
⑤將配好的培養基，用漏斗分裝到三角瓶（或試管）中，并用棉塞塞緊瓶口，瓶壁寫上號碼。瓶中培養基的量約為容量的1/4或1/5。
培養基的成分比較復雜，為避免配制時忙亂而將一些成分漏掉，可以準備一份配制培養基的成分單，將培養基的全部成分和用量填寫清楚。配制時，按表列內容順序，按項按量稱取，就不會出現差錯。