組織病理實驗（一）

實驗方法原理 石蠟切片是最基本的切片技術，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發展起來的。蘇木素與伊紅對比染色法（簡稱H.E.對染法）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用范圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可著色，便于全面觀察組織構造，而且適用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色可長期保存。

實驗材料 小鼠

試劑、試劑盒 中性福爾馬林固定液酒精二甲苯石蠟蜂蠟蘇木精染液伊紅酒精溶液鹽酸酒精溶液甘油蛋白粘片劑中性樹膠卡諾固定液

儀器、耗材 切片機恒溫箱蠟杯酒精燈解剖剪培養皿鑷子單面刀片包埋盒染色缸蓋玻片載玻片玻片盤顯微鏡溫度計水浴鍋

實驗步驟

一、材料準備：

1.  中性甲醛固定液：

甲醛（37%-40%，市售，本所購買即為此濃度）100 mL

磷酸氫二鈉6.5 g

磷酸二氫鉀（鈉）4 g

雙蒸水900 mL

2.  1%鹽酸乙醇液：

鹽酸1份

70%酒精100份

3.  甘油蛋白貼片劑：

蛋白50 ml

甘油50 ml

水楊酸鈉（防腐劑）1 g

4.  配制

（1）將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調打成雪花狀泡沫。

（2）然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經數小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。

（3）此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。

（4）最后加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用。可保存幾個月。

二、實驗步驟：

1.  取材

（1）頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織（或其他組織）。

（2）切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5 mm×5 mm×2 mm或10 mm×10 mm×2 mm 為宜。

（3）取下所需要的肝組織，切成一小塊2~3 mm 厚。

2.  固定

（1）將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下

（2）立即投入中性福爾馬林固定液中固定

（3）固定30~50 min。

3.  洗滌

材料經固定后，流水沖洗，數小時或過夜。

4.  脫水

（1）材料依次經70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，各30 min。

（2）再放入95%、100%各2次，每次20 min。

5.  透明

（1）純酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min（至透明為止）。

（2）由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經過二甲苯以過渡。

（3）當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現出不同程度的透明狀態。

6.  透蠟

（1）放入二甲苯和石蠟各半的混合液15 min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50~60分鐘。

（2）透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據組織大小而定。

（3）透蠟應在恒溫箱內進行，并保持箱內溫度在55~60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發脆。一般置于恒溫箱0.5 h。

7.  包埋

（1）包埋時，用鑷子夾取石蠟模子（金屬質地）在酒精燈上稍加熱，放在平的桌面上。

（2）從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟。

（3）再將鑷子在酒精燈上稍加熱，夾取材料將切面朝下放入蠟模中，排列整齊。

（4）再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。

8.  切片

（1）將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機的夾物臺上。

（2）將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。

（3）搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。

（4）調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。

（5）調整厚度調節器到所需的切片厚度，一般為4~10微米。

（6）一切調整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉速度不可太急，通常以40~50 r/min。

（7）切成的蠟帶到20~30 cm 長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。

（8）用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。

（9）切片工作結束后，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。