一、材料準備：
1. 中性甲醛固定液：
甲醛（37%-40%，市售，本所購買即為此濃度）100 mL 磷酸氫二鈉 6.5 g 磷酸二氫鉀（鈉）4 g 雙蒸水 900 mL
2. 1%鹽酸乙醇液：
鹽酸 1份 70%酒精 100份
3. 甘油蛋白貼片劑：
蛋白 50 ml 甘油 50 ml 水楊酸鈉（防腐劑） 1 g
4. 配制
（1）將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調打成雪花狀泡沫。
（2）然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經數小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。
（3）此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。
（4）最后加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用。可保存幾個月。
二、實驗步驟：
1. 取材
（1）頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織（或其他組織）。
（2）切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5 mmx5 mmx2 mm或10 mmx10 mmx2 mm 為宜。
（3）取下所需要的肝組織，切成一小塊2~3 mm 厚。
2. 固定
（1）將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下
（2）立即投入中性福爾馬林固定液中固定
（3）固定30~50 min。
3. 洗滌
材料經固定后，流水沖洗，數小時或過夜。
4. 脫水
（1）材料依次經70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，各30 min。
（2）再放入95%、100%各2次，每次20 min。
5. 透明
（1）純酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min（至透明為止）。
（2）由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經過二甲苯以過渡。
（3）當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現出不同程度的透明狀態。 6. 透蠟
（1）放入二甲苯和石蠟各半的混合液15 min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50~60分鐘。
（2）透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據組織大小而定。
（3）透蠟應在恒溫箱內進行，并保持箱內溫度在55~60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發脆。一般置于恒溫箱0.5 h。
7. 包埋
（1）包埋時，用鑷子夾取石蠟模子（金屬質地）在酒精燈上稍加熱，放在平的桌面上。
（2）從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟。
（3）再將鑷子在酒精燈上稍加熱，夾取材料將切面朝下放入蠟模中，排列整齊。
（4）再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。
8. 切片
（1）將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機的夾物臺上。
（2）將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。
（3）搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。
（4）調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。
（5）調整厚度調節器到所需的切片厚度，一般為4~10微米。
（6）一切調整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉速度不可太急，通常以40~50 r/min。
（7）切成的蠟帶到20~30 cm 長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。
（8）用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。
（9）切片工作結束后，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。
9. 展片、貼片
打開水浴鍋，使水溫維持在40~45℃，另準備30%乙醇溶液。
（1）切片時，將一碗30%乙醇溶液放于切片機旁的桌面上。
（2）用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片展開。
（3）小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開，用一個載玻片將切片完整，已展開的切片撈至溫水中，使之充分展開。
（4）另取潔凈的載玻片，撈起展開的切片，使其位于切片1/3處，另一端（磨邊，粗糙的一端）磨面上標記或貼上標簽，放于切片架上。
10. 脫蠟復水
（1）將水浴鍋溫度調至60℃，待水溫控制在60℃時。
（2）將切片連同切片架放入一干燥的染色缸內，放入水浴鍋中，蓋上蓋子（可密封），30 min 至蠟熔化。
（3）之后，石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5 min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各級酒精溶液中各3~5 min，再放入蒸餾水中3 min。
11. 染色
（1）切片放入蘇木精中染色約10~30 min。
（2）染色時間應根據染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。
（3）室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。
12. 水洗
（1）用自來水流水沖洗約15 min。
（2）使切片顏色變藍（或放入堿性水中也可）。
（3）但要注意流水不能過大，以防切片脫落。
13. 分化
（1）將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色。
（2）約2秒至數十秒鐘，見切片變紅，顏色較淺即可。
14. 漂洗
切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。
15. 脫水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5 min。
16. 復染
（1）用0.5%伊紅乙醇液對比染色1~3 min。
（2）伊紅主要染細胞質，著色濃淡應與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質也應濃染，以獲得鮮明的對比。
（3）反之，如果細胞核染色較淺，細胞質也應淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數滴冰醋酸助染，促使細胞質容易著色，并且經乙醇脫水時不易褪色。
17. 脫水Ⅱ
（1）將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色。
（2）然后放入無水乙醇中3~5 min。
（3）最后用吸水紙吸干多余的乙醇。
18. 透明
（1）切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5 min。
（2）二甲苯應盡量保持無水，應經常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內吸收水分。
（3）切片如在二甲苯中出現白霧現象，說明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。
19. 封藏：中性樹膠封存
因切片經二甲苯透明，使用中性樹膠作為封藏劑，樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。
20. 封藏的方法：
（1）封片前應根據材料的大小，選用不同規格的蓋玻片。
（2）材料透明后，在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上）。
（3）迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側，稍為傾斜使其左側與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產生氣泡。
（4）如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。
（5）如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。
（6）染色結果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。 三、免疫組化染色
1. 石蠟切片，步驟同前。切片經貼片后，60℃烤片30 min使蠟熔化，經二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，脫蠟。然后，將切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3~5 min，再放入蒸餾水中3 min，水化。
2. 脫蠟和水化后，用PBS（pH7.4，具體看所用抗體及染色試劑說明）沖洗3次，每次3分鐘。洗瓶沖洗。
3. 根據抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復。可選步驟，具體見抗體說明書。
4. 每張切片加1滴或50 ul 3%過氧化氫，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3分鐘。此步驟是對內源性過氧化物酶含量高的組織而言。
5. 除去PBS液，每張切片加1滴或50 ul 的第一抗體，室溫下孵育60分鐘或4℃過夜，具體參見每種抗體的說明書。PBS沖洗3次，每次3分鐘。
6. 除去PBS液，每張切片加1滴或50 ul 即用型MaxVisionTM試劑或SP試劑，室溫下孵育10~15分鐘。PBS沖洗3次，每次3分鐘。
7. 除去PBS液，每張切片加2滴或100 ul新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3~5分鐘（DAB）或37℃環境下10~30分鐘（AEC）。
8. 自來水沖洗，蘇木素復染10分鐘，PBS或自來水沖洗返藍。如果用DAB顯色，則切片經過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，步驟同H-E染色，中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。
展開 | 