方案3 用于免疫印跡的動物培養細胞、酵母和細菌的裂解實驗
| 實驗方法原理 | 去垢劑裂解細胞法通常用于培養的動物細胞。典型的離子型去垢劑SDS(如2%SDS)能充分地裂解細胞。培養的動物細胞和細菌，如可以使用這種方式裂解。假如實驗所用的抗體識別的抗原決定簇取決于自然空間構象，并對還原環境敏感，那么在裂解緩沖液中應除去二硫蘇糖醇，并建議使用非還原/無脲的凝膠（Ji，et al，1997;Ji and Simpson,1999)。 |
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| 實驗材料 | 懸浮或單層的細胞培養物、細菌或酵母細胞 |
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| 試劑、試劑盒 | 二硫蘇糖醇（DTT)樣品緩沖液 |
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| 儀器、耗材 | 離心機水浴鍋 |
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| 實驗步驟 | 1.將1X107~5X107個細胞加到1ml含有100 mmol/L DDT的Laemmli樣品緩沖液中。 2.由于DNA的釋放，在Laemmli緩沖液中細胞裂解液變得很黏，克服黏性問題有2種方法： (1)離心裂解液lOOOOOg，20 min，除去DNA; (2)超聲破碎裂解細胞，每次超聲15?30s，共4次，每次之間將樣品在冰上放置15s。 3.在95°C水浴加熱樣品5 min。 4.20000 g離心5 min。 5.轉移上清到一個新管中。 6.樣品（上清）現在可以用于電泳（見方案1)和免疫印跡（見HarlowandLane，1999)。在免疫印跡研究中，制備培養細胞提取物時，蛋白樣品必須滿足以下條件： （1）溶于適合凝膠電泳系統的溶液中（如，溶液的pH值應該在7.0左右，并且鹽濃度為200 mmol/L左右）； （2）蛋白濃度不能超過特定凝膠系統的承載能力（凝膠電泳變量的討論見第2章）。對于傳統凝膠，小膠的每個泳道的上樣量不能>150ug 的總蛋白。 展開 |
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