細胞和亞細胞提取物的制備實驗9

差異去垢劑分離法（differential detergent fractionation, DDF) 包括使用一系列含不同去垢劑的 PIPES 緩沖液對細胞進行連續抽提，首先是毛地黃皂苷，其次是 Triton, 最后是 Tween/脫氧膽酸鹽。這些步驟產生 4 種在生化和電泳上相異的組分 (見圖 3.3 和表 3.7)。包括：

1.胞質蛋白和可抽提的細胞骨架組分。用鎂沉淀的方法可以從這個組分中初步純化出微管組分（見本方案的附加方案：用鎂沉淀微管蛋白和微管結合蛋白）。

2.膜和細胞器蛋白。使用 TritonX-114 可以富集完整的膜蛋白（Bordier，1981;Pryde and Phillips,1996)。

3.核膜蛋白和可抽提的核蛋白。

4.抗去垢劑的細胞骨架纖維和核基質蛋白。骨架結合蛋白及其相互作用可進一步用不同濃度的脲來抽提、分析。

此處所述的 DDF 方案改自分離 Madin-Darby 犬腎（Madin-Darby canine kidney,MDCK) 細胞組分的方法（Fey,et al,1984)。其中的改動包括增加毛地黃皂苷提取步驟，在毛地黃皂苷和 Triton 緩沖液中加入 EDTA，并去掉了核酸酶消化步驟（在有 SDS 的存在下，DNA 被強力變性）。總 RNA 也可以用常規方法從每個變性組分中分離，并進行 Northern 雜交分析來觀察 mRNA 的動態（見附加方案：去垢劑提取物中 RNA 的分離）。該方案和附加方案均由 MelindaRamsby 和 GregoryMakowski(UniversityofConnecticutHealthCenter) 友情提供。

懸浮或單層細胞培養物

丙酮去垢劑提取緩沖液細胞骨架溶解緩沖液l X O ’Farrel裂解緩沖液lOXO’Farrel裂解緩沖液磷酸鹽緩沖液10X PIPES 緩沖液臺盼藍脲（固體）

離心機（冰凍）勻漿器聚四氟乙烯包被的玻璃面冰凍干燥器臺式混合器

一、細胞制備

1.在冰上預冷細胞培養物，然后用冰浴的鹽溶液、PBS 或其他的非變性緩沖液洗 2~3 次。

保存 1 份洗滌緩沖液（貯存在-70°C) 以備將來進行樣品校正，或用于酶、蛋白或 RNA 分析的對照材料。

2.選擇下面合適的方法來處理懸浮液或單層培養物。

處理懸浮培養物：懸浮培養的細胞所需的 DDF 體積取決于細胞的濕重或細胞數量。

（1）轉移一小管懸浮培養物到已稱重的塑料小管中，然后短暫地離心；

（2）倒出培養基，并稱出細胞沉淀的濕重；

（3）進行第二部分的第1步。

處理單層培養物：單層培養物所需 DDF 的體積取決于培養細胞的平面區域的大小或細胞數量。

（1）測出培養瓶或培養皿的表面積，或是計算一個有代表性的培養皿中細胞的數目；

（2）進行第三部分的第1步。

二、懸浮細胞的去垢劑分離

通過連續地加入和去除 DDF 緩沖液來操作 DDF，所有的提取過程都是在冰上進行，并溫和地攪動。注意提取次數對重復性是很重要的。提取物在用于實驗前應一直放在冰上，或冰凍保存（最好是一 70°C)。測出每一種去垢劑提取物的回收體積，并計算凈產量或分布百分比。每一種 DDF 緩沖液，都應保存一小管，以備將來進行樣品校正，或用于實驗的對照材料。

1.每克（濕重）洗過的細胞沉淀中加入 5 倍體積冰冷的毛地黃皂苷提取液緩沖液。溫和地旋轉，重懸細胞沉淀。

2.冰浴條件下在臺式混合器上溫和地晃動，直到被通透化（permeabilized) 的細胞達 95%~100%(約 IOmin)(用臺盼藍染色排除法估計）。

實驗提示：在不同組分分離之間保持提取次數的一致是非常重要的。

3.480 g 離心提取混合物 10 min。

4.轉移上清到另一干凈的試管中。測定上清（胞質組分）的體積后，把胞質組分分裝到幾個小管中，并把它們存在一 7℃ 條件下。此為 CYTO 組分（見圖 3.3 和表 3.7)。

5.用 5 倍沉淀體積（相對于細胞沉淀的最初重量 [由第一部分第2步所決定]) 的冰浴 TritonX-IOO 提取緩沖液仔細地重懸毛地黃皂苷不溶的沉淀，以獲得均一的懸浮液。

在 DDF 這一方案中，TritonX-114 可以替代 TritonX-100，雙向凝膠電泳分析提取組分的結果表明二者沒有明顯的區別。相對于 TritonX-100,TritonX-IU 具有更低的熔點（TritonX-100 熔點為 60°C;TritonX-114 熔點為 20°C)，并在非變性溫度下可以將樣品分為高脂相（lipid-richphase) 和低脂相（lipid-poorphase), 因而可以對膜整合蛋白和膜外周蛋白，以及可溶的細胞器內含物進行亞組分分離。

6.冰浴條件下在臺式混合器上溫和地晃動細胞 30 min。

7.5000g 離心提取混合物 10 min。

8.轉移上清液至另一個干凈試管中，測量上清液（膜、細胞器組分）的體積，分裝后在一 70°C 條件下貯存。此為 MO 組分（見圖 3.3 和表 3.7)。

9.Triton 提取殘渣用 Tween-40/脫氧膽酸鈉提取緩沖液重新懸浮，其體積為 Triton 提取（第⑤步）時所用體積的 1.5 倍。使用特氟隆（Teflon) 滑壁玻璃勻漿器 (smooth-walledglasshomogenizer)，以中等速度研磨介質 5 次，使沉淀重新懸浮。

10.6780 g 離心抽提混合物 10 min。

11.轉移上清液至另一個干凈試管中，測量上清液（核組分）的體積，分裝核組分后于一 70°C 條件下貯存。此為 NUC 組分（見圖 3.3 和表 3.7)。

12.將含有 1.2 mmol/LPMSF 的冰浴 PBS(pH7.4) 加到抗去垢劑沉淀中，使用 Teflon 研磨 3 次以重懸沉淀，然后 12000 g 離心 1Omin, 收集沉淀。

13.重復步驟12兩次以上，以徹底清洗沉淀。

14.去上清，用 90% 丙酮（一 20°C 預冷）洗沉淀一次。

15.過夜凍干沉淀（細胞骨架/核基質組分）。

16.在已知重量的離心管中測出沉淀的重量，于一 70°C 條件下貯存樣品。此為 CSK/MAT 組分（見圖 3.3 和表 3.7)。

通常情況下細胞懸浮液的 CSK/MAT 組分的產率很高。因而，貯存冷凍干燥的沉淀組分更為方便，用時只需用非變性的細胞骨架溶解緩沖液來重懸已測定過重量的沉淀。

17.進行第四部分的操作。

三、單層細胞培養物的去垢劑分離

通過連續地加人和去除 DDF 緩沖液對 DDF 進行操作。所有的提取過程都是在冰上進行的，并溫和地攪動。注意提取次數對重復性是重要的。實驗前，提取物應維持冰浴，或冰凍保存（最好是-70℃)。測出每一組去垢劑提取物的回收體積，并計算凈產量或分布的百分比。每一種 DDF 緩沖液要保存一小管以作隨后的樣品校準或作為實驗的對照材料。

1.直接加 1ml 冰浴的毛地黃皂苷提取緩沖液到 T-25 培養瓶中的單層培養細胞上。

典型的 T-25 培養瓶能容納約 5X1O⁶ 個細胞。T-75 培養瓶或 100 mm 培養皿應加人 3 ml 的毛地黃皂苷提取緩沖液。

2.冰浴條件下在臺式混合器上溫和地晃動細胞懸浮液，直到 95%~100% 的細胞被通透化（約 1O min)(用臺盼藍染色排除法 [Trypan blue exclusion] 檢測）。

實驗提示：維持不同組分分離的提取次數的一致性是非常重要的。

3.傾斜培養瓶，將液體（胞質組分）倒入一個小的培養會。殘余溶液用吸管轉移入培養管中。測定胞質組分的體積，分裝后在一 70°C 條件下貯存。此為 CYTO 組分（見圖 3.3 和表 3.7)。

4.每個 T-25 培養瓶（約 5X1O⁶ 個細胞）中加入 1ml Triton 提取緩沖液。

在 DDF 這一方案中，TritonX-114 可以替代 TritonX-100，雙向凝膠電泳分析提取組分的結果表明二者沒有明顯的區別。相對于 TritonX-100,TritonX-114 具有更低的熔點（TritonX-100 熔點為 60°C;TritonX-114 熔點為 20°C), 并在非變性溫度下可以將樣品分為高脂相（Hpid-richphase) 和低脂相（lipul-poorphase), 因而可以對膜整合蛋白和膜外周蛋白，以及可溶的細胞器內含物進行亞組分分離。

5.冰浴條件下在臺式混合器上溫和地晃動細胞 30 min。

6.傾斜培養瓶，將液體（膜和細胞器組分）到入一個小培養管中，殘余溶液用吸管轉移人培養管中。測定該組分的體積，分裝后在一 70°C 條件下貯存。此為 CYTO 組分（見圖 3.3 和表 3.7)。

7.每個 T-25 培養瓶（約 5XIO6 個細胞）中加入 0.5?I.0 mlTween-40/脫氧膽酸鈉提取緩沖液體來提取單層細胞。

8.傾斜培養瓶，將液體（核組分）到入一個小培養管中，殘余溶液用吸管轉移入培養管中。測定核組分的體積，分裝后在一 70°C 條件下貯存。此為 NUC 組分（見圖 3.3 和表 3.7)。

9.用 PBS 在原位浸沒單層細胞。

10.向培養瓶中加入 1?3 ml 的無/3-巰基乙醇的非變性細胞骨架溶解緩沖液，對抗去垢劑殘渣進行提取。傾晃培養瓶以懸浮殘渣。測量體積（細胞骨架和基質組分），分裝后在一 70°C 條件下貯存。此為 CSK/MAT 組分（見圖 3?3 和表 3?7)。

非變性細胞骨架溶解緩沖液的體積取決于細胞類型和培養時間（即胞外基質的量）。一般，1~3 ml 是合適的范圍。

11.進行第四部分的操作。

四、蛋白濃度的測定

1.在冰上融化去垢劑緩沖液和提取物。

2.用水稀釋毛地黃皂苷/EDTA 和 Triton/EDTA 提取物（對于懸浮培養物的提取物加入 4 倍體積的水，單層培養物的提取物中加人 2~3 倍體積的水）。Tween/DOC 提取物則不用稀釋。

3.在無β-巰基乙醇的細胞骨架溶解緩沖液中溶解冷凍干燥的 CSK/MAT 沉淀。每 1Omg(干重）沉淀使用 1ml 緩沖液。如果需要可以對單層培養物的 CSK/MAT 進行稀釋。

4.每個樣品取 20~50ul，用 BCA 方法（見附錄 2) 測定，重復兩次。

另一種測定蛋白質濃度的方法是 Peterson 的福林（Folin)-酸法 (1983)，該方法對于去垢劑的干擾不敏感。建議不使用標準的 Lowry 方法，因為在實驗中會有由垢劑誘導的凝聚發生（M.Ramsby，未發表）。

五、使用雙向凝膠電泳分析蛋白質組分

不同細胞類型的 DDF 樣品可用于二維 PAGE 分析，包括 IEF 和非平衡 pH 梯度電泳（nonequilibriumpHgradientelectrophoresis,NEpHGE)。有關雙向凝膠的例子，參見 Ramsby 等（1994) 以及 Ramsby 和 Makowski(1999)。新鮮的或融化的 DDF 提取物（置于冰上）首先要標準化，使蛋白含量相同，然后添加固體脲至終濃度 9.5mol/L0

1.對于 100ul 的樣品，加入 85 mg 脲和 15ul 10xO’Fairell 裂解緩沖液，加熱至室溫作用。

2.對于干燥的 CSK 提取物，可在 IXO7FarreIl 裂解緩沖液中直接溶解（O’Farrell，1975;O’Farrell，et al，1977)。

3.對于非還原 SDS 緩沖液中的 CSK 提取物，通過加入固體脲和加入 1OXO’Farrell 裂解緩沖液，至終濃度 9.5mol/L。

加固體脲和 1OXO’Farrell 裂解緩沖液，以便盡可能地減少由稀釋帶來的影響，并盡可能地檢測低豐度蛋白。稍微加熱樣品有利于脲的溶解，但是避免過熱（增加溫度/或延長加熱時間），否則可能會導致人為的氨基甲酰化。

4.使用 2D 電泳分析 DDF 樣品（有關方法參見 O’Farrell，1975;1OXO’Farrell，etal，1977; 或參見第 4 章）。

5.LEF 凝膠（見第 4 章）含有 3.5% 兩性電解質（2% 對應 PH5~8，1% 對應 pH3?10，0.5% 對應 pH2~5)，樣品需要電泳 9800V.h, 其中在最后 1 個小時用 800V 聚焦（Duncan and Hershey，1984;Ramsby,etal，1994)。

6.NEpHGE 凝膠含有 2% 兩性電解質（PH3~10)，樣品需電泳 2400V.h(Ramsby,etal，1994)。

通常在 15~60 沁的樣品含量達到 25~1OOyg 的蛋白，就足以通過考馬斯亮藍或放射自顯影觀察到；低豐度蛋白可通過銀染檢測到。實驗表明，樣品中的去垢劑緩沖液的體積多少不會對 IEF 凝膠 pH 梯度的線性范圍產生不利的影響。但是，含有 Tween/DOC 的樣品可能引起向低 pH 的輕微漂移。