細胞介導細胞毒作用檢測法3：LDH釋放法

LDH釋放法

1）測定方法

1．用含5％小牛血清的RPMI-1640培養液將靶細胞調整到5×10⁴～2×10⁵/ml，此濃度需根據情況預先標定。

2．在96孔圓底細胞培養板中加入靶細胞，每孔加100μl。3個效應細胞自然釋放對照孔不加靶細胞，只加100μl培養液。

3．向各孔加100μl效應細胞，效應細胞與靶細胞的比例根據要求而定，通常為5：1～20：1。自然釋放孔不加效應細胞只加100μl培養液，最大釋放孔中加100μl 1％ NP₄₀。每個實驗置三個復孔。

4．置37℃ 5％ CO₂的二氧化碳培養箱中培養4～6小時。

5．離心培養板200×g 10分鐘。每孔吸出150μl上清液，對應加入另一塊96孔酶聯檢測板中。向第二塊板每孔依次加20μl 0.4mol/L乳酸溶液、20μl 4mmol/L 2-p-碘苯酯-3-p-氯化硝基苯四唑，20μl反應液（含0.03％ BSA，2.7U/ml硫辛酰胺脫氫酶，4.5mmol/L氫化型輔酶I（NAD^＋），1.2％蔗糖的PBS），室溫中放置20分鐘。

6．在酶聯檢測儀上測定各孔的光密度（OD值），檢測波長492nm，參考波長650nm。

2）特異性殺傷活性的計算

殺傷活性（％）＝[（OD實驗組－OD總自然釋放）/（OD最大釋放組－OD總自然釋放）]×100％