細胞凍存與復蘇實驗

實驗原理：

凍存和復蘇的原則：慢凍快融。

當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反，結晶就大，大結晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。復蘇細胞應采用快速融化的方 法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

實驗材料

15ml離心管、培養皿、滴管 、酒精燈、培養瓶、培養液、PBS、75%酒精、0.25%胰酶、超凈工作臺、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、顯微鏡、計數板、離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、液氮罐、凍存管、凍存液、廢液缸等。

實驗步驟：

一、細胞凍存

1.吸取傳代后的細胞懸液，離心，去除培養液，加入凍存液，分裝凍存管（凍存管內細胞數目一般為（5～10）×106個/ml，2ml凍存管中一般放1～1.5ml細胞）。

2.按步凍存

冷凍保存方法一：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。

冷凍保存方法二：冷凍管置于已設定程序之程序降溫機中每分鐘降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮長期保存。

二、細胞復蘇

1.取出冷凍管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，移入無菌操作臺內。

2.打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。

3.1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。

4.加適當培養液后將細胞轉移至培養瓶中，37℃培養，第二天觀察生長情況。

注意事項

1、吸取過營養液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養液中。

2、不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內部，吸管前部等所有可能不細胞接觸的部分，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

3、開啟、關閉長有細胞的培養瓶時，火焰滅菌時間要短。防止因溫度過高燒死細胞。

4、換液時傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過快，防止廢液四濺。

5、吹打細胞時，要注意邊角的細胞是否吹打下來。

6、手或相對較臟的物品丌能經過開放的瓶口上，即不可以在開放容器上方操作。

7、每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。

8、注意自身的安全，對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心。操作過程中，應避免引起氣溶膠的產生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。

9、從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用于凍存，但最好為對數生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養液。

10、將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。

11、凍存和復蘇最好用新配制的培養液。