常用的細胞冷凍貯存器為液氮貯存器，規格有35L3和50L3兩種。
細胞凍存時常備的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培養液，DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（121℃蒸氣高壓消毒），2ml 安瓿（或專用細胞凍存管）、吸管、離心管、噴燈、紗布袋（或凍存管架）等。
主要操作步驟為：
（1）選擇處于對數生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個培養瓶中的細胞培養液去掉，用0.25%
胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養液。用吸管吸取培養液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心（1000r/min，10分鐘）。
（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培養基，于4℃預冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為3×106～1×107/ml之間。
（3）將上述細胞分裝于安瓿或專用冷凍塑料管中，安瓿裝1～1.5ml在火焰噴燈上封口，封口處要完全封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細胞種類及代次、凍存支數）。
（4）將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內；置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時，再移至冰箱冷凍室內3～4小時（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態部分存放2小時，最后沉入液氮中。
2. 分布降溫法
細胞系凍存程序：
1) 單層細胞的消化。將經24～48小時培養已長成單層的傳代細胞培養物棄去生長液，加適量ATV，1～2分鐘后倒棄ATV，再加入少量ATV液，經
0.5～1分鐘倒去ATV，室溫或37oC溫箱作用2～3分鐘，視細胞解離情況，拍打細胞培養瓶。使單層細胞完全解離。SP2/0瘤細胞，待生長好后用吸管吹打，再經1000轉/分離心l0分鐘。
2) 離心洗滌：向培養瓶內加5～10m1預冷的MEM使細胞懸浮，再將其吸出置滅菌離心管中，以1000rpm 離心8～10分鐘后棄去上清液。
3) 細胞懸液的制備：向離心管內逐滴緩慢加入預冷的凍存保護液，使細胞濃度為150~400萬/ml，然后迅速分裝于安瓿瓶中，每瓶加量為lml。
4) 致冷凍結：將安瓿瓶放入帶有棉墊的紙盒或塑料盒內，直立置不同條件下致冷凍結果保存：
a. 4℃兩小時后移至-20℃作用2小時，再移入-40℃4小時后在-70℃下24小時投入液氮。
b. -20℃4小時后移至-40℃，經4小時移人-70℃冰箱24小時，投入液氮。
c. -40℃4小時后移入-70℃24小時后投入液氮。
d. -20℃4小時后移入-70℃經24小時后投入液氮中。
e. -70℃24小時后投入液氮中。
5) 液氮中保存：將凍結后的安瓿裝入預冷的小布袋中，投入液氮。為防止安瓿漂浮，可預先在小布袋中加入幾塊小卵石。
3. 玻璃化法
玻璃化保存（Vitrification）是一種超速冷凍方法。它是以極快的速度冷凍細胞，使細胞內外的游離水迅速形成玻璃樣物質，而不形成冰晶。這種保存方法既避免了由于慢速降溫時導致的鹽濃度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理損傷，可獲得較高存活率。
玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他認為生命是生物活體系統的原子或其他結構元的一種特殊排列．并且輕微的排列位置擾動就會破壞平衡從而導致死亡，而結冰時的驅動力會破壞這種特殊的排列，這就是冰凍死亡的原因。玻璃化比凍結固化方法引起的結構變化要小，因而是一種較理想的低溫保存途徑。
1981年，Fahy首先明確提出，用高濃度的低溫保護劑溶液，可在較慢地冷卻速率以及高壓條件下實現完全的玻璃化，以后又發展了一些所謂“玻璃化溶液”，使細胞、組織乃至器官等范圍廣泛的生物系統玻璃化低溫保存成為可能。
1985年，Rail和Fahy用這種玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存獲得成功，是這種技術走向實用化的首次突破。