細胞凍存與復蘇方法

細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少人力、經費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。
一、凍存和復蘇的原則：慢凍快融
當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。
如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反，結晶就大，大結晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。
二、慢凍程序
1、標準程序：采用細胞凍存器
當溫度在-25 ℃以上時， 1~2 ℃/min；
當溫度達-25 ℃以下時， 5~10 ℃/min；
當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中。
2、簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。
3、傳統程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽長期儲存。
三、低溫保護劑的應用
在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。
常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。
四、細胞凍存方法
1、預先配制凍存液
10%DMSO + 細胞生長液（20%血清+基礎培養液）
10%甘油+ 細胞生長液（20%血清+基礎培養液）
2、取對數生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存液， 用吸管吹打制成細胞懸液（1×106 ~ 5 ×106細胞/ml）
3、加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存
五、保存細胞的復蘇方法
1、快速解凍
凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內全部融化（不要超過3 分鐘）。
2、解凍后的細胞可直接接種到含完全生長培養液的細胞培養瓶中直接進行培養，24小時后再用新鮮完全培養液替換舊培養液，以去除DMSO。
3、如果細胞對冷凍保護劑特別敏感
解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養液的培養瓶中。