細胞凍存和復蘇技術原理和操作步驟

一、原理

在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。

目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

二、操作步驟

（一）凍存

1、消化細胞，將細胞懸液收集至離心管中。

2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

3、沉淀加含保護液的培養，計數，調整至5×106/ml左右。

4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。

5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現爆裂。

6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。

7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態氮（30分鐘）→液氮。

注意：操作時應小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，絕對不能揮發干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）復蘇

1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內裝2/3杯37℃的溫水。

2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。

3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。

4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。

5、沉淀加10ml培養液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。（細胞數量少的情況下，復蘇時可省略步驟5。）

6、加適當培養基后將細胞轉移至培養瓶中，37℃培養，第二天觀察生長情況。

三、試劑和器材

器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機等。

試劑：0.25％胰酶、培養基、含保護劑的培養基（即凍存液）。

附：凍存液配制：

培養基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存。

我感覺只要DMSO的濃度保持在10％就可以了，血清的濃度影響不是很大的。我曾經用90％的血清＋10％的DMSO也用過50％DMEM+40% 血清＋10％DMSO凍存細胞，復蘇后細胞都能成活。并且我是在細胞離心后用凍存液懸浮后，分裝到凍存管中-80度過夜，后直接存放于液氮中。