實驗方法原理 在不附加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內外環境中的水會結成冰晶，能導致細胞發生一系列變化，如機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH 改變、蛋白質變性等等，最終導致細胞死亡。
但如向細胞培養液中加入保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使冰點降低，在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，可避免上述現象的發生。
凍存在－135 ℃以下低溫中，能減少冰晶的形成。而融化細胞時速度則要快，使之迅速通過最易受損的－5~0 ℃以后，細胞活力不受損害，仍能生長增殖。當前最常用的保護劑仍為甘油和DMSO，它們對細胞無毒、分子量小、溶解度大、易穿透細胞，使用范圍在5%~15 %之間，常用10 %。
實驗材料 細胞
試劑、試劑盒 胰蛋白酶BSSDMSO
儀器、耗材 吸管離心管玻璃安瓿酒精燈線繩紗布口袋搪瓷罐
實驗步驟
一、凍存
1. 細胞
選項對數生長期細胞；收集細胞24 小時前換液一次；
2. 計數
按常規法把細胞制成細胞懸液，計數、令細胞密度達5×106 /ml （如一瓶細胞數量不足則用兩瓶或更多的細胞），離心去上清， 吸入離心管中；
3. 凍存液
先用培養液9 分+DMSO 1 分（或甘油）配成10%的DMSO凍存液；按上法一滴滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸；
4. 分裝
分裝入無菌安瓿中，每安瓿加1.5 毫升細胞懸液；
5. 封口
用塑料安瓿時擰緊瓶口即可；如用火焰封閉安瓿口后，仔細檢查，定要封嚴，必要時可浸入藍色液中觀察，為安全起見，把安瓿縫入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時因受熱發生爆炸傷人；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明：細胞名稱，凍存日期，以便日后查找；
6. 凍存
當前已有專用細胞凍存器；在無凍存器的情況下，可用手工辦法；從把凍存物懸在液氮罐口開始算起，按－1 ℃分鐘速度，在30~40 分鐘內，下降到液氮面，再停30 分鐘后，直投入液氮中。
二、復蘇
1. 從液氮罐中取出安瓿；有時因安瓿未封嚴，浸入了液氮，取出后因安瓿內液氮迅速氣化而發生爆炸（力量有限），因此應帶防護眼鏡和手套；
2. 迅速放入盛有36 ℃~37 ℃水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時搖動，盡快解凍；
3. 剪開紗布口袋，取出安瓿，用70%酒精擦拭消毒后，凈化臺上打開蓋（如為玻璃安瓿則折斷安瓿頸部；用吸管吸出細胞懸液，裝入離心管中，再補加10 ml 培養液，吹打使細胞懸浮）；
4. 低速離心（500~1000 轉/分）5 分鐘，取上清后再重復用培養液漂洗、離心；
5. 加入培養液適當稀釋后，再移裝入培養瓶中，置溫箱培養，次日更換一次培養液后再繼續培養。
注意事項
1. 操作時應帶保護眼鏡和手套，以免液氮傷人。
2. 細胞注入安瓿中后一定封嚴；最好使用塑料制螺口安瓿，但一定要擰緊螺帽。
3. 安瓿內凍存細胞數量要充分，在融解后能允許做1：10 倍或1：20 倍的稀釋（細胞數/毫升）；
4. 一般每瓶細胞接種濃度為5×105 /ml，因此凍存密度應達到107 /ml，在稀釋20 倍時，仍能保持5×105 /ml 數量。
其他
一、要點
1. 為保持細胞最大存活率，一般都采用慢凍存融的方法。
2. 凍存物距液氮面越近溫度越低。標準的低凍速度為－1℃~12℃/分鐘，當溫度下降達－25℃時，下降速度可增至－5~－10℃/分鐘，到－100℃時則可迅速凍入液氮中。因此要適當掌握凍存物下降入液氮中的速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促冰晶形成。