細胞的凍存

實驗方法原理 已長滿的細胞經胰蛋白酶處理后，重懸于凍存液中。兩種試劑即甘油和 DMSO 是常用的細胞保護劑，它們在細胞保存液中起到防止細胞內冰晶形成的目的。血清的濃度經常增加至 20%。

實驗步驟

1) 吸干已長滿細胞的細胞瓶內培養液。

細胞不應在高密度狀態下凍存，并應在凍存的 24 小時內換液。

2) 加 2 ml 胰蛋白酶（T-25 細胞培養瓶）處理細胞。

3) 讓液體在細胞表面來回流動 4~5 次。

4) 吸干胰蛋白酶液。

5) 重復步驟 3 和 4。

6) 置 37°C 3~5 分鐘。

7) 將細胞從細胞培養瓶表面洗下，重懸細胞于 3~5 ml 培養液中。

8) 離心，200 g，5 分鐘；重懸沉淀于 1 ml 凍存液中。

凍存液

細胞生長培養液（RPMI,DMEM 等）    7 ml

FBS                                                            2 ml

甘油或 DMSO                                           1ml

小心：甘油；DMSO

甘油或 DMSO 的濃度介于 5%~20% 之間。生長培養液的體積應調整以適于所用細胞保護劑的變化。

如果欲凍存懸浮細胞，沉淀 5x106~10x106 對數生長期細胞，重懸沉淀于 1 ml 凍存液中。

9) 加入 1 ml 細胞（單層細胞約為 3x106~5x106; 懸浮細胞約為 5x106~10x106) 于

凍存管上標明細胞系的名稱、日期和生長培養液。

10) 置凍存管于 Nalgene 細胞凍存器中，并讓細胞凍存管在-80°C 過夜或利用可控速率的冷凍裝置。

11) 次口，將凍存管轉移至液氮中。此步驟操作宜迅速，凍存液不應融化。