細胞凋亡中Caspase-3活性的檢測主要應用于（1）酶的活力測定（2）細胞凋亡指標檢測。
| 實驗方法原理 | Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。 |
|---|
| 實驗材料 | 細胞 |
|---|
| 試劑、試劑盒 | 磷酸緩沖液蒸餾水脫脂奶粉Caspase-3多抗吐溫Ac-DEVD-AMC |
|---|
| 儀器、耗材 | 硝酸纖維素膜PVDF膜熒光分光光度計UV流式細胞計燒杯移液管引流棒 |
|---|
| 實驗步驟 | 1、收集細胞；
2、PBS洗滌；
3、抽提細胞裂解液；
4、蛋白定量；
5、SDS-PAGE電泳，硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移，5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5——2h或4°C過夜；
6、Caspase-3多抗或單抗室溫反應1——2h或4℃過夜，TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5——10min/次；
7、HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1——2h→ TBS-T洗3次， 5——10min/次；
8、ECL顯影或NBT/BCIP顯色。 展開 |
|---|
| 注意事項 | 1. 整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞；
2.反應完畢后盡快在一小時內檢測。 |
|---|
| 其他 | 1. 結果采用Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
2. 此外還有熒光分光光度計和流式細胞術分析法。 |
|---|
