一、大分子染色體DNA 片段的測定
細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300 kbp 長的DNA 大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA 分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA 的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時,即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA,DNA 像通過彎管一樣,以其一端指向電場一極而通過凝膠,這種遷移模式稱之為"爬行"。因此,細胞凋亡早期產生的50~300 kbp 長的DNA 大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變后,大的DNA分子便滯流在爬行管中,直至新的電場軸向重新定向后,才能繼續向前移動。DNA分子量越大,這種重排所需要的時間就越長。當DNA 分子變換方向的時間小于電脈沖周期時,DNA 就可以按其分子量大小分開。
二、DNA Ladder 測定 收獲細胞(1X107)沉淀?細胞裂解液13000 rpm′5 min, 收集上清1%SDS和RnaseA(5 mg/ml)56 °C,2 h。蛋白酶K(2.5 mg/ml)37 °C,2 h,1/10 體積3 M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA,4 °C過夜。14000 rpm′15 min最后將沉淀溶解在TE buffer中,加DNA Loading Buffer 1.2 %瓊脂糖凝膠電泳,EB染色并照相。 三、凋亡細胞DNA 含量的流式細胞計分析 收集細胞,70 %冷乙醇(in PBS)4 °C 固定過夜,PBS 洗滌,1000 rpm′10 minRNase A(0.5 mg/ml)37 °C 消化30 min PI(50 mg/ml)染色,室溫避光15 min,FACScan 分析DNA 亞二倍體的形成及細胞周期的變化。 四、ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH) 敏感度高,適合于檢測少量樣本,小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。 展開 |