細胞凋亡檢測

實驗概要

細胞凋亡是細胞生物學研究的重要領域。檢測藥物或某種處理對于細胞細胞的影響時，細胞凋亡檢測是一個重要檢測指標。以Annexin V聯合PI法為例簡述細胞凋亡檢測。

實驗原理

在細胞凋亡早期，位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）遷移至細胞膜外側。磷脂結合蛋白V（Annexin V）是鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它與PS具有高度的結合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外側的PS，將Annexin V標記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時結合使用PI拒染法（因壞死細胞PS亦暴露于細胞膜外側，且對PI高染）進行凋亡細胞雙染法后用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。正常活細胞Annexin V和PI均低染；凋亡細胞Annexin V高染，PI低染；壞死細胞Annexin V和PI均高染。

主要試劑

0.25%Trypsin、細胞基礎培養液、DPBS（4℃預冷）、Annexin V-eGFP、100 μg/mL PI、10×Binding Buffer、1×Binding Buffer

主要設備

流式管

實驗步驟

（1）收集細胞
收集懸浮細胞培養液至15 mL離心管，2000 r/min離心5min，棄上清。
貼壁細胞用0.25%Trypsin消化后，加入等體積細胞基礎培養液終止反應，收集細胞懸液至15 mL離心管，2000 r/min離心5min，棄上清。
注意：Trypsin消化時間不宜過長，以防引起假陽性。
（2）加入4℃預冷的DPBS重懸細胞，2000 r/min離心5min，棄上清。
（3）重復第（2）步一次。
（4）用400μL 1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×10⁶細胞/mL。
（5）在細胞懸浮液中加入5μL Annexin V-eGFP，輕輕混勻后于2～8°C避光條件下孵育15 min。
（6）加入10μL100 μg/mLPI后輕輕混勻，于2～8°C避光條件下孵育5 min。
（6）在1 h內用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測，以綠色熒光為橫軸，PI的紅色熒光為縱軸作圖，左下象限的細胞群為正常細胞，右上象限的細胞群為凋亡細胞。
 
注意：

1. 操作過程要輕柔，不可用力吹打細胞；
   

2. 實驗操作完成后盡快進行分析，避免熒光隨著時間延長而淬滅；
   

3. 雙染需要流式細胞儀調節熒光補償，所以需要各種熒光單染的細胞作為對照。