【材料】
1試劑:吖啶橙貯存液(10mg吖啶橙溶解于100mLPBS中,過濾,4℃避光保存),0.01mol/L、Ph6.8PBS。
2器材:吸管,試管,玻片,熒光顯微鏡。
【方法】
1制備待檢活細胞懸液,濃度約為1×107/mL。
2取95uL的細胞懸液,加5uL的吖啶橙貯存液混勻。
3吸一滴混合液,點于潔凈玻片上,直接用蓋玻片封片。
4熒光顯微鏡觀察或避光保存于4℃,待觀察。
【結果】
在熒光顯微鏡下,細胞核DNA為黃色或黃綠色均勻熒光,細胞質和核仁的RNA為桔黃色或桔紅色熒光。出現細胞凋亡時,細胞核或細胞質內可見致密濃染的黃綠色染色,甚或見黃綠色碎片。細胞壞死時,細胞質內黃綠色或桔黃色熒光均可減弱或消失。
(2)瓊脂糖凝膠電泳法
【原理及意義】
培養或單細胞懸液用細胞裂解液消化細胞按常規法提取DNA后,置于含溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳,細胞出現PCD時呈典型的“梯狀”條帶,而壞死時,呈模糊的彌散膜狀條帶。
【材料】
1試劑:緩沖液,細胞裂解液,Rnase(10mg/mL溶于TE緩沖液中),醋酸鈉,乙醇,苯酚和氯仿。
2器材:電泳槽,電泳儀。
【方法】
1約106細胞洗脫后,1000r/min離心5min,去上清。
2用4mL的PBS重懸洗后,同法離心去上清。
3置液氮中驟冷,5min(無條件可省略)。
4加0.5~1mL細胞裂解液重懸細胞,50℃,過夜,不時振搖。
5加等體積酚和氯仿、異戊醇各抽提1次(充分混勻,5000g,5min)。
6取上清加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉和2.5倍體積的無水乙醇,混勻。
7液氮10min,1000g,5min離心沉淀DNA,70%乙醇洗1次后,真空抽干,溶入500uLTE緩沖液中。
8加入25uL Rnase,37℃水浴,30min。
9取所制備的樣品1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察。