細胞劃痕實驗原理步驟及注意事項有哪些

細胞劃痕實驗原理

細胞劃痕實驗(Wound Healing)是一種操作簡單，經濟實惠的研究細胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗方法。這種方法的原理是，當細胞長到融合成單層狀態時，在融合的單層細胞上人為制造一個空白區域，稱為“劃痕”，劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區域使“劃痕”愈合，在一定程度上模擬了體內細胞遷移的過程，是研究細胞遷移的體外實驗中較簡單的方法。細胞劃痕實驗是一種簡單易行的檢測細胞運動的方法，實驗成本低，可以用來檢測貼壁生長腫瘤細胞的侵襲轉移能力。

實驗材料：細胞樣品
儀器、耗材：6孔板 marker筆 直尺 *頭 20微升槍頭(滅菌)
試劑、試劑盒：無血清培養基、PBS

實驗步驟：
一.準備：
所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和marker筆在操作前紫外照射30min（超凈臺內）
二.流程：
(1)準備工作：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和marker筆在操作前紫外照射30min(超凈臺內)

(2)先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。

(3)在空中加入約5X105個細胞，具體數量因細胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。

(4)第二天用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不要傾斜。

(5)用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基。

(6)放入37℃5%CO2培養箱培養。按0、6、12、24小時取樣，拍照。

注意的幾個問題：

1、劃痕前是不倒培養基的，劃痕后再倒掉培養基加PBS清洗后加吳學謙培養基；
細胞長到融合成單層狀態時，在融合的單層細胞上人為制造一個空白區域，稱為“劃痕”。劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區域使“劃痕”愈合。因此是整個培養皿都加培養基的，觀察部位是劃痕而已。
2、通過算每個視野的劃痕面積，可以通過image J 軟件計算。
3、劃痕法的意義在于，價格低廉，操作簡單。還有很重要的一點在于細胞外圍環境簡單單純，容易控制。（比如做加藥的，可能會和血清的組分有反映，而且受血清批次的影響，造成誤差。如果是鋪了ECM物質的，組分就更復雜了。）
.劃痕法測量適用的細胞范圍較小，一般只適用于上皮細胞，纖維樣細胞。因為
a.這些細胞本身有遷移能力，且較強。
b.細胞有極性，方便測量，觀察。
c.細胞對無血清有較強的忍受力（至少24小時），因此很多腫瘤細胞系是不適合做劃痕的，很多腫瘤細胞系在無血清培養下，12小時細胞凋亡就超過50%。這也就是transwell發展的大要求。而一些上皮樣細胞系甚至可以忍受高達72小時的無血清實驗。足以彌合劃痕。
4、其實在傷口彌合中，fibroblast的向創口處遷移就是典型的側向爬行。但是其實癌細胞的遷移倒不是側向爬行那么簡單，我覺得應該是綜合效應，而且要看是什么類型的腫瘤。因為對于遠端病灶的轉移，顯然是通過血液運輸的。這是一個細胞去黏附和再黏附的過程。其實transwell也不能很好的模仿這個過程。只是transwell+matrigel可以模仿腫瘤細胞融解基質，侵入到正常組織的這個過程。也就是侵襲。所以對于做cancer的來說，可能transwell會更好些。但我覺得并不能就簡單否定scar assay。細胞的遷移作為細胞的一個正常生理活動，是表征細胞生理變化的一個重要指標。這點是很主要的意義。