細胞原代培養實驗

胎鼠 新生鼠

1640培養基 牛血清 胰酶 Hank’s液 碘酒

培養箱 培養瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿 吸管 移液管 紗布 手術器械 血球計數板 離心機 水浴箱

一、實驗材料準備

1.  Hank’s液配方：KH₂PO₄ 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO₃ 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na₂HPO₄·H₂O 0.06 g，加H₂O至 1 000 ml。Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。

二、具體操作

1.  將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內（或將新生小鼠在超凈臺內）解剖取肝臟，置平皿中。

2.  用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。

3.  用手術剪將肝臟剪成小塊（1 mm²），再用Hank’s液洗三次，轉移至小青霉素瓶中。

4.  視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。

5.  加入3-5 ml培養液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。

6.  靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。

7.  1 000 rpm，離心10分鐘，棄上清液。

8.  加入Hank’s液5 ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。

9.  加入培養液1-2 ml（視細胞量），血球計數板計數。

10.  將細胞調整到5×10⁵/ml左右，轉移至25 ml細胞培養瓶中，37℃下培養。

1.  自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。
 

2.  在超凈臺中，組織細胞、培養液等不能暴露過久，以免溶液蒸發。
 

3.  凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。

4.  操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
 

5.  點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
 

6.  操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。
 

7.  不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。
 

8.  瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
 

9.  吸溶液的吸管等不能混用