一、原代細胞培養原理
原代細胞培養是將機體內的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制以及細胞的衰老、死亡等生命現象。
? 幼稚狀態的組織和細胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養
? 掌握無菌操作技術
? 了解小鼠解剖操作技術
? 了解原代細胞培養的一般方法與步驟
? 了解培養細胞的消化分散
? 了解倒置顯微鏡的使用
二、實驗材料
? 實驗動物：孕鼠或新生小鼠
? 液體：細胞生長液（內含20%小牛血清）
0.25%胰蛋白酶
平衡鹽溶液
70%乙醇
? 器材：滅菌鑷子、剪刀若干把
滅菌培養皿、細胞培養瓶、小瓶、燒杯若干個
吸管若干支
酒精燈
原代細胞培養方法
三、胰酶消化法
（1）胰酶消化法操作步驟——取材
a. 用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整個孕鼠浸入盛有75%乙醇的燒杯中數秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。
c. 用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。
d. 用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養皿上。
e. 剔除胚胎周圍的包膜（若胚胎較大，應剪去頭、爪），將胚胎放于無菌的含有平衡鹽溶液的培養皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡鹽溶液。繼續用平衡鹽溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。
（2）胰酶消化法操作步驟——切割
a. 將部分胚胎轉移至一個無菌小瓶中，用平衡鹽溶液漂洗。
b. 然后用眼科手術剪刀小心地絞碎胚胎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發白為止。
c. 靜置，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。
（3）胰酶消化法操作步驟——消化、接種培養
a. 視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。
b. 加入3-5ml細胞生長液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。
c. 靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
d. 1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。
e. 加入平衡鹽溶液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。
f. 加入細胞生長液l-2ml（視細胞量），血球計數板計數。
e. 將細胞調整到5×105/ml左右，轉移至25ml細胞培養瓶中，37℃下培養。
（4）胰酶消化法操作步驟——消化、接種培養
a. 視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次。
b.靜置，吸去上清，用平衡鹽溶液漂洗消化后的組織塊，用吸管反復吹打組織塊，使細胞分離，靜置，使未分散的組織塊下沉。
c. 取細胞懸液接種至加了細胞生長液的培養瓶中（調整細胞濃度到5×105/ml左右），37℃下培養。
（注意：省略了離心、計數等步驟）