細胞同步化實驗操作步驟

在腫瘤細胞培養過程中，細胞多處于不同的細胞周期時相中。不同時相的細胞對藥物干預存在不同的反應，會影響實驗的重復性，因此需要制備細胞周期一致的細胞。細胞同步化是解決該問題的好辦法。細胞同步化是利用藥物或其他方法使細胞停止在細胞周期的某個時相的技術，其基本原則是使細胞停留在細胞周期的特定時相上；停滯過程可以通過調節，恢復細胞周期；恢復后所有細胞以一致的步調在細胞周期中運行。細胞同步化實驗為特定細胞周期轉變、細胞動力學、細胞周期調控以及細胞在不同時相中對藥物的敏感性研究奠定了基礎。

【實驗用品】

材料：HeLa細胞

器材：培養瓶、移液器、槍頭、小燒杯、10ml吸管橡皮頭、超凈工作臺、CO2，孵箱、倒置相差顯微鏡、離心機

試劑：無血清培養基、胎牛血清、RPMI-1640培養液、0.25％胰蛋白酶溶液、PBS

【實驗步驟】

(1)血清饑餓法(將細胞周期阻滯在G0／G1)：

1)用0．25％胰蛋白酶消化對數生長期HeLa細胞，收集腫瘤細胞，600g離心5min，棄上清液。

2)用37℃預溫pH7．4的PBS或無血清培養基洗滌細胞2次，重懸于培養液中，培養液中血清濃度低于O.5％。

3)在CO2孵育箱中37℃、5％CO2以及飽和濕度的條件下，培養24～48h。

4)棄去無血清培養液，加入正常血清濃度的培養液，使細胞重新進入細胞周期。細胞約在12h后進入S期。

(2)胸苷法(誘導細胞停滯在Gl／s期交界)：

1)添加含2mmol／L胸苷的新鮮培養液于培養對數生長期HeLa細胞細胞的培養瓶中。

2)在CO2孵育箱中37℃、5％CO2以及飽和濕度的條件下，培養12h。

3)棄去含有胸苷的培養液，用等量的完全培養液洗滌貼壁細胞2次。更換新鮮培養液，在37℃的CO2孵育箱中孵育16h。

4)棄去培養液，再加入2mmoL／I_胸苷的新鮮培養液，并孵育12～14h。

5)重復本實驗(2)胸苷法中的第3)步驟。

(3)有絲分裂搖落法(將細胞截獲于M期)：

1)取覆蓋瓶底70％～80％的HeLa細胞細胞1瓶，棄去原培養液，用無血清培養液沖洗。然后加入：3ml 0．1％胰蛋白酶消化5min。輕叩培養瓶，使松動細胞游離下來。

2)60％離心5min，并調整細胞濃度至2．5x105個／ml，種入培養瓶，于37℃的CO2孵育箱中孵育6h。

3)搖動培養瓶，棄去未貼壁的細胞，更換培養液2次。加入培養液繼續培養10h。

4)在10h結束，輕輕搖動或輕叩培養瓶，收集M期細胞，600g離心5min，并用培養液將細胞濃度調整到2．5×105個／ml。

5)種入培養瓶，于37℃的CO2孵育箱中孵育2h，細胞進入G1期。以上方法可應用流式細胞儀檢測獲得細胞的細胞周期(見流式細胞儀檢測細胞周期)。

【結果分析】

根據以上三種方法進行得到不同時相的同步化細胞，用流式細胞儀檢測細胞群體的細胞周期的均一性。

【注意事項】

(1)血清饑餓法必須注意無血清培養液處理細胞的時間，時間過長將引起細胞不可逆進入G0期或凋亡。

(2)有絲分裂搖落法必須注意胰蛋白酶的消化時間，過長的消化時間將引起其他周期的腫瘤細胞數目增加。