細胞因子生物學活性檢測實驗古朵實驗√

白細胞介素1是一種重要的細胞因子，主要由單核-巨噬細胞產生，IL-1不僅對多種免疫活性細胞有重要的調節功能，而且與發熱、炎癥發生以及某些疾病的病理變化有關。目前對IL-1產生水平的檢測主要應用生物學活性檢測的方法。

一、ConA刺激小鼠胸腺細胞檢測IL-1生物學活性
 
小鼠胸腺細胞在絲裂原刺激下表達IL-1受體，在有IL-1同時存在的條件下，IL-1可協同絲裂原促T細胞的增殖作用。根據加入IL-1后增殖水平（3H-TdR摻入率）的增加可計算出樣品中IL-1的活性單位，或計算出刺激指數。

二、應用EL-4 CTLL檢測IL-1生物學活性
 
小鼠胸腺瘤細胞系EL4的某些亞克隆細胞表面具有高密度IL-1受體，在IL-1誘導下產生高水平的IL-2，通過用IL-2依賴株CTLL-2檢測IL-2的生物學活性，從而反映檢測樣品中IL-1的水平。

實驗材料：
ConA EL4細胞 CTLL-2細胞
試劑、試劑盒     
FCS RPMI1640 3H-TdR PPO POPOP 二甲苯
儀器、耗材     
濾紙 收集儀 計數儀 96孔板 吸管 滴管 試管 加樣器 CO2培養箱

實驗步驟：

一、ConA刺激小鼠胸腺細胞檢測IL-1生物學活性

1.  取6～8 周齡C57BL16小鼠，拉頸處死，無菌取胸腺置不銹鋼網篩上，用注射器針蕊研磨成細胞懸液調整細胞數為1.5×107 /ml

2.  細胞懸液內加入ConA，使終濃度為3 μg/ml，在96孔培養板中加100 μl（1.5×106細胞）

3.  加入不同稀釋度待測樣品和IL-1標準品100 μl/孔（ConA終濃度為1.5 μg/ml），37 ℃  CO2孵箱 66 h

4.  每孔加3H-TdR 0.5 μci，37 ℃ CO2孵箱 6 h

5.  多頭細胞收集儀收獲于9999型玻璃纖維紙上

6.  烤干，移入液閃瓶中，加適量閃爍液，于液閃儀上測β計數

7.  計算

（1）從IL-1標準曲線上測得IL-1的活性單位

（2）也可用刺激指數（SI）表示
 
實驗組cpm
SI＝────── ×100％
    對照組cpm

二、應用 EL-4 CTLL檢測IL-1生物學活性
 
1.  用EL4細胞兩步法檢測IL-1活性

（1）收集處于對數生長期的EL4細胞

（2）洗滌后，用1 ％FCS RPMI1640重懸細胞，并調整細胞濃度2×106 /ml

（3）加處96孔板中，100 μl/孔

（4）加入不同稀釋度的IL-1α或IL-1β，100 μl/孔，同時設1 ％FCS RPMI 1640對照

（5）5 ％CO2 37 ℃培養18～24 小時

（6）按終稀釋度為1∶10～20轉入另一塊96孔板中

（7）用CTLL-2 檢測IL-2活性、檢測方法見"IL-2檢測"

2.  用EL4細胞一步法檢測IL-1活性

（1）用5 ％FCS RPMI 1640調整EL4細胞濃度至2×105 /ml，CTTL-2濃度至4×105 /ml

（2）加入96孔板中，兩種細胞各加50 μl/孔

（3）加入不同稀釋度的IL-1或待測樣品，同時設EL4和CTLL-2細胞對照    

（4）置5 ％CO2，37 ℃培養24～28 小時后加入3H-TdR，0.5 μci/50 μl/孔，繼續培養6～8 小時

（5）收集樣品，β計數

注意事項 ：

一、ConA刺激小鼠胸腺細胞檢測IL-1生物學活性

1.  不同品系小鼠對IL-1的反應性有差異，據國內資料報道以C57BL為好。
 
2.  不同周齡小鼠胸腺細胞對ConA反應性不一，一般選用6～8 周齡，小于5 周或大于10 周齡小鼠胸腺細胞對ConA反應不穩定。

3.  ConA促絲裂原作用要進行預試，一般采用亞適劑量。

二、應用EL-4 CTLL檢測IL-1生物學活性

1.  在一步法檢測IL-1時，其EL4細胞濃度不宜超過1×104 /孔，血清終濃度應＜5％。

2.  在二步法檢測IL-1時，其EL4細胞濃度在2×105 /孔時，轉移上清稀釋度不宜低于1∶8，其誘導時間應12～24 小時間為佳。誘導血清濃度應≤1％。

3.  在檢測經誘導的上清中IL-1時，應避免使用A23187，TPA和ConA等較強的能誘導EL4細胞產生IL-2的誘導劑來刺激IL-1的產生。