細胞固定切片和包埋實驗

貓 部分顯露肌梭

二甲砷酸鈉緩沖液 戊二醛 四氧化鋨 乙醇 環氧乙烷 甲苯胺藍 派羅寧

玻片

一、固定

1. 將取出的肌肉置于含 5% 戊二醛的 0.1mol/l 二甲砷酸鈉緩沖液內，PH 值為 7.2, 原位固定 5 min(戊二醛常由 25% 溶液稀釋而成。因其易聚合，所以使用之前應保存于 4℃ 以下)。

2. 將肌纖維切成 10 mm 長，以確保至少含有一個肌梭，用上述相同固定液再固定 4~14d(總固定時間因實驗室而異，固定時間的差異一般不會明顯影響固定效果)。

3. 緩沖液清洗 30 min。

4. 置于緩沖液配制的 1% 四氧化鋨固定 4 h(四氧化鋨滲透速度很慢，但薄短筒狀肌的厚度小于 1 mm，4 h 足以充分固定。一般將四氧化鋨配成 2% 的儲存液，裝瓶并密封后儲存于冰箱內。配制固定液時，向儲存液內加入等量的 0.2mol/L 二甲砷酸鈉緩沖液，便稀釋成了所需的終濃度)。

二、脫水和包埋

1. 室溫下將標本用 70%、95% 和 100%(兩次）的梯度乙醇脫水，每次 10 min。

2. 用 1:1 的乙醇與環氧丙烷（1,2-環氧丙烷）混合液處理 15 min[環氧丙烷常用作中間溶媒，在石蠟包埋法中發揮類似「透明劑」的作用。大多數透明劑的折射指數與脫水蛋白及其他細胞內成分相似。該名稱的由來是因為最初它們被用來固定透明的組織，雖然現在知道它們幾乎沒有這樣的功能，但這個名稱一直沿用至今。其他脫水方法見 Glauert(1975)]。

3. 環氧丙燒處理 15 min。

4. 用 1:1 的環氧丙燒與 Epon 的混合物（除了加速劑以外的成分）浸透，置入敞口的容器內，通風櫥內過夜（揮發的環氧丙烷能幫助硬化劑更好地向組織塊滲透)。

5. 倒掉瓶內剩余的滲透媒質，移入新鮮的純 Epori 中。

6. 將切片平整地包埋于內襯鋁箔的模具內，先 45℃聚合 12 h, 再 60℃聚合 24 h

三、切片和染色

1. 借助常規玻璃刀用超薄切片機手動切片，片厚 1/um，每 10 張切片收集為 1 組 (如需要，可用帶氯仿蒸氣的刷子靠近切片或通過電熱絲的輻射熱使切片平鋪于水面上。玻璃刀應該經常更換，更換時應注意玻璃刀的準確復位，使用機械開關控制刀的運動以確保連續切割時能得到相同的切片。由于刀與組織塊表面間的距離僅有幾個微米，為了在更換新刀后仍能準確定位，可將刀背照亮，此時刀刃與組織塊表面的縫隙看起來呈一條亮線)。

2. 用鉆石刀將蓋玻片（標準尺寸為 50 mmX20 mm) 切割成 3 mm 寬的窄條，將窄條的一端浸入液面下直接從水槽內收集切片（圖 1-1A)(這些切片有的排列成串，有的單獨存在。用一根粘有睫毛的牙簽可以很容易地將切片導入窄條的表面，窄條需用鐘表鑷夾持,. 將窄條的一面靠近切片呈舌尖樣伸出的一端，再使切片干燥，這個方法既簡便又能使切片很好地粘附在窄條玻片上)。

3. 用軟的織物將窄條的背面擦干，任切片漂浮在窄條前端的水滴中。

4. 用一塊溫度約為 70”C 的熱板使切片干燥并貼附于窄條表面 [最好將一塊玻璃載玻片永久性地固定于熱板上，而將窄條置于載玻片上烘干（圖 I-IB)]。

5. 用甲苯胺藍（toluidineblue)(圖 1-2A) 和派羅寧（pyronine)(圖 1-2B) 在尚 pH 值條件下染色，將一滴染液滴于切片表面，加熱直到染液滴從邊緣處開始干燥為止。水洗后用 95% 乙醇分色 [染料配制：將 0.1 g 甲苯胺藍、0.05 g 派羅寧和 0.1 g 硼砂 (四硼酸鈉）溶于 60 ml 蒸餾水即可，配好的染液應定期過濾]。

6. 在熱板上干燥后用 DPX[distrene(聚苯乙烯)-plasticizer(塑化劑)-xylene(二甲苯)] 封片 [一張載玻片上放置 5 個窄條，每個窄條有 10 張切片，用 50 mmX22 mm 的蓋玻片封片（圖 1—1C)。當然，封片時應注意將貼有切片的一面朝上]。
   

結果

貓的薄短筒狀肌內肌梭的初級終末占據肌梭中部，大約長 350 mm，為了完整地觀察肌梭，約需觀察 50 張 1um 厚的縱向連續切片。通常認為肌梭的初級終末由單根 Ia 類初級傳入纖維發出的外周終末分支及有髓或無髓纖維的終末前分支系統構成，這些有髓或無髓纖維的終末分支常分布于梭內肌纖維。梭內肌通常由六根三類不同的肌纖維構成。圖 1-3 所示是使用 100 倍的消色差油鏡（NA=1.25) 拍攝的照片；尺寸小于 0.5/um 的結構大部分已因溶解而丟失了。每個視野有一段長超過 100 啤的肌梭。照片中所見到的最顯著結構是一根梭內肌纖維的中間部，就是核袋纖維。: 在初級終末區，梭內纖維的肌小節幾乎全被聚集的胞核取代（圖 1-3C 中的 n)。纖維表面的突出物是感覺終末（圖 1-3F 中的 t)。在這些切片上都能見到有髓（圖 1-3B 中的 mpt) 及無髓（圖 1-3E 中的 pt) 感覺纖維的終末前分支部分。終末內的暗結構主要是線粒體。幾個附屬的、纖維母細胞樣的細胞圍繞在核袋纖維的周圍并形成鞘-圖 1-3 G 是基于相鄰的連續切片重塑的、表面有感覺終末附著的核袋纖維的輪廓圖。Banks 于 1986 年發表了完整終末的三維重塑圖，1997 年 Banks 等人又將相似的連續切片分析法應用于初級終末的多編碼位點以及與肌收縮控制器（pacemaker) 相互作用的組織-生理學相結合的研究。