細胞培養基的滅菌方法

　　培養基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及過濾除菌。與過濾相比，高壓滅菌的工作強度小，成本較低，但易造成營養成分的流失，而且在多次加樣（無菌谷氨酰胺溶液，無菌碳酸氫鈉溶液等）過程中容易造成二次污染。

　　大多數培養基采用0.1～0.2μm孔徑的微孔濾膜進行過濾滅菌，并且已成為培養基除菌的發展方向，它可低限度地減少培養基的營養損失。

　　1、高壓滅菌

　　某些培養基（如MEM）可進行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養基中的MD605、MD609等。這類培養基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，一般是在培養基高壓滅菌后加入L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的無菌的液體。另外可用耐高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）代替L-谷氨酰胺。可高壓滅菌的培養基在121℃、15psi，15分鐘的條件下完全可達到滅菌效果及營養成分的最小損失，不需將滅菌時間延長。為保證高壓滅菌的效果，滅菌設備的驗證很關鍵。

　　2、過濾除菌

　　目前培養工作中采用的培養用液包括人工合成培養液、消化用酶等，常含有維生素、蛋白質、多肽、生長因子等物質，這些物質在高溫或射線照射下易發生變性或失去功能，因而上述液體多采用過濾消毒以除去細菌。可供過濾滅菌使用的濾膜很多，其材料多為polyethersulphone（PES）、尼龍、多聚碳酸鹽、醋酸纖維素、硝酸纖維素、PTFE、陶瓷等。目前常用的濾器有Zeiss濾器、玻璃漏斗式濾器和針式微孔濾器。

　　其中，Zeiss濾器為不銹鋼的金屬結構，中間夾有一層石棉制成的一次性纖維濾板。濾板具有一定的厚度，可承受一定的壓力，因此是過濾粘稠液體較理想的濾器。濾板有不同的規格，進口的型號為EKS，EKS2，EKS3等。國產的有甲1、甲2、甲3等，其中以EKS3及甲3過濾除菌的效果較好，但因孔徑很小，過濾速度較慢。Zeiss濾器可分為抽濾式或加壓式抽濾式濾器與抽濾瓶相連，真空泵抽氣形成負壓以過濾液體，其效率不如加壓式。由于抽氣造成負壓抽吸，操作使用時要防止倒流而引起污染，因此要注意避免將出、入管道接錯；停止抽氣時應使用氣體緩慢回流，要先用止血鉗夾住抽氣管再關機，防止氣體回流。加壓式濾器的容器為密閉式，加入待過濾的液體后，通以氣體（常用N2、O2），形成壓力將液體濾過，效果較佳。使用時注意壓力不能過大，不應超過0.2kg/cm2。另外，由于使用的濾板為石棉，濾過的液體內有時可能混有少許雜質，因此在過濾前應先以少量生理鹽水濕潤濾板。Zeiss濾器的清洗比玻璃濾器簡單，濾板屬一次性，使用后即可棄去，以自來水將金屬濾器初步沖洗，用洗滌劑刷洗干凈，自來水沖凈，蒸餾水漂洗2-3次，晾干包裝。消毒前將濾板裝好，旋鈕不要擰得太緊，消毒后立即將旋鈕擰緊以保證過濾除菌的效果。此外，也可在石棉濾板上加一層濾膜，以增加過濾效果。

　　玻璃濾器為玻璃結構，以燒結玻璃為濾板固定于玻璃漏斗上，可用于過濾各種培養液體。只能采用抽濾式。根據濾板孔徑的大小分為G1-G6六種規格型號，其中只有C5及C6可用以過濾除菌，一般都使用C6型，但過濾速度較慢。玻璃濾器的使用方法與抽濾式Zeiss濾器相同，但清洗過程比較繁瑣。玻璃濾器使用后及時用自來水沖洗濾器表面的剩余物，然后用單蒸水浸泡，除去濾板內堵塞雜物，若用濾膜則將濾膜丟棄，加4N鹽酸浸泡12小時以上，用自來水沖洗，再用單蒸水抽濾2次，雙蒸水（或去離子水）抽濾沖洗、包裝、121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。也可用5%的潔消精浸泡20分鐘后，再按上述方法沖洗和滅菌。

　　微孔濾膜濾器的基本結構與Zeiss濾器相同，為金屬結構，其中間為一種一次性的特制混合纖維素脂濾膜，可用于各種培養液體的過濾除菌，速度較快。效果較好，現已為許多實驗室所使用。濾膜的規格很多，主要根據濾器的直徑大小而劃分型號，可接待過濾液體的量來選擇適當的型號。濾過大量培養液時，一般多用直徑10cm（容器量為500ml）及直徑15cm（容器量為2000ml）兩種規格。用于小量培養液時，可選用2.5cm直徑濾器，以注射器推動壓力而過濾。濾膜的選擇是效果好壞的關鍵。有孔徑為0.6、0.45、0.22um三種濾膜，用以過濾除菌時，最好使用0.22um孔徑的濾膜（可以除去細菌和霉菌）。由于濾膜很薄，在濾器的上層和下層的相應部位各有一凹槽以放置一硅膠墊圈來固定、壓緊濾膜。安裝濾膜時要注意，濾膜薄而且光滑，容易移動。千萬不能裝偏而是過濾失敗；同時要注意濾膜的正反面，正面（光面）應向上。由于濾膜薄，承受壓力有限，力量不能過大、過猛，以免濾膜破裂。大量培養液過濾通常裝上兩張膜，上面為0.45um，下面為0.22um。每次過濾完畢應打開濾器，核實濾膜是否搖動或破裂，以保證有效過濾除菌。微孔濾膜濾器的清洗、消毒方法和Zeiss濾器相同，濾膜使用后即丟棄。