細胞培養基應具有一定的緩沖能力。細胞培養過程中造成細胞培養液 pH 波動的主要物質是細胞代謝產生的CO2。在封閉式培養過程中CO2與水結合產生碳酸，細胞培養液pH 很快下降；打開培養器具時CO2逸出則會引起pH升高。細胞培養基通常采用NaHCO3-CO2緩沖系統，按下列化學反應方程式調節細胞培養基的pH值：
H2O + CO2 → H2CO3 ? H+ + HCO3－
NaHCO3 ? Na+ + HCO3－
此外，還有緩沖能力較高的磷酸鹽緩沖系統。但碳酸鹽緩沖系統的細胞毒性小、成本低，在細胞培養中應用得更為廣泛。另一種較為常用的緩沖液是HEPES（羥乙基哌嗪乙硫磺酸）液，它是一種非離子兩性緩沖液，在pH 7.0 ~ 7.2范圍內具有較好的緩沖能力。高濃度的HEPES可能對細胞有毒性作用，細胞培養時HEPES的添加濃度一般為10～25 mmol/L。