細胞培養技巧

細胞復蘇

        細胞復蘇和凍存講究“慢凍快溶”，復蘇時一定要將凍存在液氮或-80℃中凝固的細胞凍存液快速融化至37℃，使胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

復蘇準備

●打開水浴鍋加熱至37℃。

● 超凈臺上放好離心管（一般15ml的），細胞培養瓶，移液管，紫外滅菌至少20至30分鐘，吹風5至10分鐘除去臭氧。

● 37℃預熱好要復蘇細胞的培養液，也可以不用預熱培養液，根據細胞情況選擇。

●向離心管中加約5至10ml培養液，從液氮罐或-80℃中取出凍存細胞，立即將凍存管放入37℃水浴中并輕輕搖動，待融化后（約2min即可）立即將解凍的細胞轉移至含培養液的離心管中，800-1000rpm下離心5min，棄上清，加適量完全培養液輕輕吹打重懸細胞后轉移至細胞培養瓶中，輕晃使瓶底液體分散均勻，標好細胞名稱、代數、復蘇日期，顯微鏡下觀察后放入37℃，5%CO2培養箱中。一般貼壁細胞過夜即可貼壁，換液和傳代時間根據不同細胞生長情況而定。

細胞復蘇注意事項

?復蘇時動作要快，盡量減少胞內形成冰晶，影響復蘇后細胞活率。

? 融化時盡量不要碰到管口，以免容易造成污染。

?若一次性需要復蘇細胞很多，可以分批水浴解凍，防止傳熱不佳使得細胞融化時間延長。

?若需要同時復蘇好幾種細胞，提前在離心管和培養瓶上做好標記，或記住自己擺放的位置，不要弄混亂。

細胞傳代培養     

1. 懸浮細胞傳代

待培養液中酚紅指示劑變黃，在已紫外滅菌后的超凈臺上吸出或倒出細胞懸液至離心管中（根據細胞液的量選擇15ml或50ml離心管），800-1000rpm下離心5min，棄去營養匱乏的舊培養液，加預熱好的完全培養液適量，輕輕吹打重懸細胞后，吸取適量細胞懸液轉移至細胞培養瓶中，或直接取適量細胞懸液至新培養瓶中，再補加一定量新鮮完全培養液進行傳代，有些脆弱的細胞用自然沉降法沉降細胞，吸去上面舊培養液加入新的完全培養液后吹散進行傳代。傳代接種的細胞密度根據不同細胞生長情況而定，一般間隔1-2天即可傳代一次。

2. 貼壁細胞傳代

待培養瓶底中細胞覆蓋率達70%-80%時，在經紫外滅菌后的超凈臺上，棄去舊細胞培養液，用無菌1*PBS洗滌瓶底細胞1-2次，用1ml（T25培養瓶）或2ml（T75培養瓶）trypsin溶液37℃下作用細胞，待顯微鏡下細胞回縮變圓，少部分細胞出現流沙狀時，快速吸去trypsin溶液，加預熱好的新鮮完全培養液終止消化，輕輕吹打使細胞脫落且分散均勻，直接吸取適量細胞懸液轉移至新培養瓶中，或800-1000rpm下離心去上清，加適量新鮮完全培養液吹打重懸細胞，然后轉移適量細胞懸液至新培養瓶中，再加入一定量完全培養液，搖勻瓶底細胞液后進行培養。

細胞傳代培養注意事項

? 吹打時每次不要排完移液管中液體，同時控制吹打節奏，這樣不容易吹出泡沫，泡沫對細胞有損傷作用，而且很難再顯微鏡下觀察清楚有沒有完全吧細胞吹打下來。

?不要等到貼壁細胞完全鋪滿瓶底，要留有一定空隙時細胞狀態才良好。

?消化時最好不要等到細胞成片飄起，否則細胞狀態受影響且第二天培養中死細胞較多。

細胞凍存

       凍存的細胞要處在指數生長期。懸浮細胞和貼壁細胞經離心后用凍存液重懸，計數，凍存的細胞密度一般3*106-1*107 cells/ml，最好不少于1*106 cells/ml，否則復蘇后難以養起來，將重懸計數后的細胞懸液以1-1.5ml快速分裝至各凍存管中，迅速擰緊蓋子，放入梯度凍存盒然后置于-80℃過夜，也可以先4℃放置30分鐘，再-20℃放置1-2小時，最后-80℃過夜（16-18小時），若梯度凍存盒不夠或無凍存盒，可以將凍存管置于泡沫盒中，用棉花包起來，棉花厚度約1cm，置于-80℃過夜，第二天取出-80℃細胞存放至液氮罐中，并在記錄好存放位置信息。

凍存準備

●配制好凍存液。一般凍存液為培養液，血清，DMSO按照7:2:1的比例配制，也可以血清和DMSO按照9:1配制，不管哪種凍存液配制，血清多多益善，但DMSO都不可以多，以免對細胞造成損傷。

●準備好凍存管，標上細胞名稱，代次，凍存批號，凍存日期。

●準備好細胞程序降溫盒或凍存用的材料，程序降溫盒放置室溫后使用。

細胞凍存注意事項

?程序降溫盒有無需有毒異丙醇填充的，有利于實驗人員身體健康。

?DMSO有毒且皮膚會吸收，做好防護措施。DMSO本身不長菌，不需要做滅菌處理。

?由-80℃轉至液氮時迅速，避免溫度上升影響細胞活性。

?每個凍存管不要加入體積太多，以免凍存時凝固體積膨脹，撐開凍存管，且在下次復蘇時，融化較慢，導致復蘇后細胞存活率不高。