利用細胞培養瓶可對細菌進行溶源性檢查,具體操作方法如下:
1.溶源菌培養:將經LB斜面活化的大腸桿菌225(λ),接種于裝有20mlLB培養液的250ml細胞培養瓶內,30℃振蕩培養16h,再從中取2ml菌懸液接入另裝有20ml LB培養液的250ml三角瓶內,37℃振蕩培養2h至對數期。
2.排除游離噬菌體:如待檢菌株為芽孢桿菌,可先制成孢子懸液,再經80℃ 10min處理,殺死溶源菌表面可能吸附的及游離的噬菌體;如待檢菌抹為非芽孢桿菌,可利用噬菌體制備的抗血清或0.2%檸檬酸鈉溶液洗滌對數期溶源菌細胞,除去表面吸附的及游離的噬菌體。然后經4000r/min離心10min,上清液可加人敏感指示菌做雙層平板測定,用于檢驗樣品屮足孖釕游離的噬菌體及吸附「溶源菌表曲的噬菌體,離心后的菌體細胞進行誘導處理。
3.誘導溶源菌:離心后收集的菌體用無菌生理鹽水洗滌兩次,用生理鹽水或100mmol/l Tris-HCL緩沖液(pH7.0)制成終濃度為1011個/ml細胞的菌懸液,每皿加5ml菌懸液,經紫外燈30W,距離30cm、照射30s,立即加入5ml雙倍濃度的LB培養液,混勻后37℃黑暗中培養2h。
4.溶源性菌株檢查:按雙層瓊脂法操作,取上述誘導裂解液加入幾滴氯仿,以10倍稀釋法適當稀釋,選擇后3個稀釋度的稀釋液,毎個稀釋液取0.3ml與0.2ml對數期敏感大腸桿菌226菌懸液混勻,再加入融化后冷卻至45℃的LB半體培養基,立即混勻,隨即傾入LB固體培養基平板上,待凝固后,37℃培養6h觀察。經過培養的平板如果有大量噬菌斑出現就證明被檢菌株是溶源菌。
檢查細菌是否具有溶源性可按照以上步驟進行操作,操作時注意過程中的無菌性,避免因操作不當影響檢測結果。