細胞增殖檢測：MTT實驗經驗總結

MTT分析法以活細胞代謝物還原劑3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑藍為基礎。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下 tetrazolium環開裂，生成藍色的formazan結晶，formazan結晶的生成量僅與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT還原）。還原生成的formazan結晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶標儀測定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數目。也可以用DMSO來溶解。
 
MTT粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。
 
一、步驟
 
1、接種細胞
 
用含10%胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000－10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。
 
2、培養細胞
 
同一般培養條件，培養3－5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。
 
3、呈色
 
培養3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.繼續孵育4小時，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。
 
4、比色
 
選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
 
二、注意事項
 
1、選擇適當得細胞接種濃度。
 
2、避免血清干擾：一般選小于10%的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。
 
3、設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。
 
MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系，
 
IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！
 
三、舉例
 
各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入計算公式：
 
Pm=0.95
 
Pn=0.06
 
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
 
Xm=lg0.1=-1
 
lgI=lg0.1/0.01=1
 
lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025
 
IC50=0.00025
 
有一個公式可供參考；
 
lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）
 
Xm：lg 最大劑量
 
I：lg（最大劑量/相臨劑量）
 
P：陽性反應率之和
 
Pm：最大陽性反應率
 
Pn：最小陽性反應率
 
抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值
 
公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率
 
例：
 
用96孔板培養SMMC-7721肝癌做MTT測細胞活力，應該加多少1640培養基，多少MTT和DMSO合適?根據書上說的加 200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定
 
一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加 150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。

一般要低于IC50，避免非調亡性殺傷的細胞太多，造成流式細胞儀檢測碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用時間為36h。一般腫瘤細胞系空白處理的調亡率應低于1%，用藥后一般為5-10%（Annexin V），細胞周期的亞G0峰比較明顯。