細胞增殖檢測：MTT法

MTT 分析法以活細胞代謝物還原劑 3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT 噻唑藍為基礎。MTT 為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素 C 的作用下 tetrazolium 環開裂，生成藍色的 formazan 結晶，formazan 結晶的生成量僅與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT 還原）。還原生成的 formazan 結晶可在含 50% 的 N，N-二甲基甲酰胺和 20% 的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的 MTT 溶解液中溶解，利用酶標儀測定 490 nm 處的光密度 OD 值，以反映出活細胞數目。也可以用 DMSO 來溶解。

細胞樣品

10% 胎小牛血清 MTT 溶液 DMSO

96 孔板 離心機 酶聯免疫監測儀

1、接種細胞

用含 10% 胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔 1000－10000 個細胞接種到 96 孔板，每孔體積 200ul。

2、培養細胞

同一般培養條件，培養 3－5 天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。

3、呈色

培養 3－5 天后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml 用 PBS 配）20ul. 繼續孵育 4 小時，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加 150ul DMSO，振蕩 10 分鐘，使結晶物充分融解。

4、比色

選擇 490nm 波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1、選擇適當得細胞接種濃度。

2、避免血清干擾：一般選小于 10% 的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。

3、設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。

MTT 實驗吸光度最后要在 0-0.7 之間，超出這個范圍就不是直線關系，

IC50 是半抑制率，意思是抑制率 50％ 的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到 50％ 抑制率時候的藥品濃度，就是 IC50。要點：藥品 2 倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！

舉例

各組濃度 0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數為 10，最大濃度為 0.1，抑制率為 0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入計算公式：

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025

IC50=0.00025

有一個公式可供參考；

lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）

Xm：lg 最大劑量

I：lg（最大劑量/相臨劑量）

P：陽性反應率之和

Pm：最大陽性反應率

Pn：最小陽性反應率

抑制率=1-加藥組 OD 值/對照組 OD 值

公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率

例：

用 96 孔板培養 SMMC-7721 肝癌做 MTT 測細胞活力，應該加多少 1640 培養基，多少 MTT 和 DMSO 合適? 根據書上說的加 200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加 DMSO 之前要盡量去掉培養液，便于 DMSO 溶解甲臜顆粒進行比色測定

一般每孔 4000 個細胞為宜，既細胞濃度在 20000 個/ml，MTT 加 20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加 150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩 10 分鐘，然后測吸光值。

一般要低于 IC50，避免非調亡性殺傷的細胞太多，造成流式細胞儀檢測碎片太多。我一般用 1/2-1/3 的 IC50，作用時間為 36 h。一般腫瘤細胞系空白處理的調亡率應低于 1%，用藥后一般為 5-10%（Annexin V），細胞周期的亞 G0 峰比較明顯。

MTT 粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。