細胞培養技術
細胞周期的測定
一、原理
細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。
單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。
測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養基后，可做為細胞DNA復制的原料，經過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器、用品：同常規細胞培養
2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液
三、操作步驟
1、細胞生長至指數期時，向培養液中加入BrdU，使最終濃度為10μg/ml。
2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。
3、48小時后常規消化細胞至離心管中，注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。
4、常規染色體制片（見第三部分：染色體技術）。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液，流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。
8、鏡檢100個分裂相，計第一、二、三、四細胞期分裂指數。
9、計算：細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）
附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。
（2）2×SSC配制： NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉-2H2O0.88克，加水至100ml，4℃保存。
細胞的凍存和復蘇
一、原理
在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的-5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。
二、操作步驟
（一）凍存
1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
3、沉淀加含保護液的培養，計數，調整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中，每管1ml。
5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現爆裂。
6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（-30℃ 1小時）→氣態氮（30分鐘）→液氮。
注意：操作時應小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，絕對不能揮發干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）復蘇
1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內裝2/3杯37℃的溫水。
2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。
3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。
4、 1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。
5、沉淀加10ml培養液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。
6、加適當培養基后將細胞轉移至培養瓶中，37℃培養，第二天觀察生長情況。
三、試劑和器材
器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機等
試劑：0.25%胰酶、培養基、含保護劑的培養基（即凍存液）
附：凍存液配制：
培養基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5～20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后 4℃下保存。
細胞系或細胞株的建立
一、概念
1、細胞系（Cell Line）：原代培養舞經首次傳代成功即成細胞系，由原先存在于原代培養物中的細胞世系（Lineage of Cells）所組成。
2、細胞株（Cell
Strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得具有特殊性質或標志物稱為細胞株。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養期間始終存在。如果不能繼續傳代或傳代數有限，稱為有限細胞株（finitecell
strain）；如果可以連續傳代，稱為連續細胞株（continuous cell
strain）。對于人類腫瘤細胞，在體外培養半年以上，生長穩定，并連續傳代的即可稱為連續性株或系。
二、建立細胞系（或株）的要求
什么樣的體外培養群可被認可為己鑒定的細胞，視具體情況而定，無統一規定。對于用作原代培養的細胞只要供體均一，取材部位及組織種類等條件穩定即可，如用做長期培養，特別是反復傳代的細胞，常需做如下說明：
1、組織來源：細胞供體所屬物種，來自人體或者動物；
個體性別、年齡；取材的器官或組織。
如系腫瘤組織，應說明臨床和病理診斷，以及病歷號等。
2、細胞生物學檢測
了解細胞一般和特殊的生物學性狀，如細胞一般形態，特異結構，細胞生長曲線和分裂指數，倍增時間，接種率等。
如為腫瘤細胞，為說明來源于原腫瘤組織并保持惡性，須做軟瓊脂培養，異體接種致瘤和對正常組織侵潤力等實驗。
3、培養條件和方法；應說明細胞系（或株）適應的生存環境，即指明使用的培養基、血清種類、用量以及適宜PH值。
三、若干細胞建株的要點及基本過程
（一）腫瘤細胞培養技術要點
1、取材：材料主要來源于外科手術或活檢瘤組織，取材時避免用壞死組織，要挑選瘤細胞集中和活力較好的部位，瘤性轉移淋巴結或胸腹水是較好的培養材料。取材后盡快培養，因故不能立即培養者，可凍存。其培養方法及凍存方法同前述正常組織。
2、成纖維細胞排除：在腫瘤組織中常混雜有一些成纖維細胞，培養時能與瘤細胞同時生長，并常壓過癌細胞，導致癌細胞生長受阻以至消失，應仔細排除。
排除方法常有：機械刮除法、反復貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。
3、提高腫瘤細胞培養存活率和生長率：根據實驗經驗，腫瘤細胞在體外不易培養，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。一般當腫瘤組成或細胞被原代培養后，要經過對新環境的適應才能生長，因此不能局限于一般培養法，須采用一些特殊措施。如：用適宜底物，鼠尾膠原底層及飼細胞底層等。用細胞生長因子，根據細胞種類不同選用不同的促細胞生長因子，如胰島素、氫化可的松，雌激素等。也可以考慮動物媒介培養。