三、神經膠質細胞培養
神經細胞（神經元）不易培養，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經生長因子和膠質細胞因子時，可出現一定程度的分化，長出突起等現象，但很難使之增值。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。
人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養，不僅能獲得生長的膠質細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質細胞在培養中生長不穩定，不易自發轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發轉化。
培養方法如下：
1、從手術室無菌取腦髓灰質或白質后，仔細剝除腦膜、血管和纖維成分，置Hanks液中漂洗一、二次。
2、置于30—50倍體積的Hanks液中，此時腦組織比較柔軟，反復吹打即制成細胞懸液。
3、把懸液注入離心管室溫中直立5—10分鐘后，細胞或細胞團快自然下沉，脂肪等雜物易漂浮，可吸除上層、反復二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎塊并獲較多細胞成分。
4、在沉降物中加入適量培養液，通過紗網成紗布過濾，計數并調整細胞密度。
5、接入培養瓶或皿中，置5%CO2溫箱中培養。
該細胞適應環境過程較長，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內也可能不見細胞分裂現象，然而一旦生長后即能迅速進入旺盛的增殖狀態。細胞傳代可以 0.25%胰酶消化處理。
四、肌組織培養
各種肌組織均可用于培養，以心肌和骨骼肌較實用。
（－）骨骼肌細胞培養
1、出生1一2天的乳鼠，引頸處死。
2、無菌取大腿肌組織，切成0.3一0.5cm2小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，無菌紗網或紗布濾過。
3、計數調整細胞密度。
4、快接種量2×106/皿入培養基培養。
5、培養基內含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進分化。
接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠。
該細胞接種率約50%，細胞生長開始呈紡錘形，培養50－52小時后出現融合形成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止，此時可觀察到橫紋，一般在融合后二、三天內能見到收縮現象。
（二）心肌細胞培養
心肌細胞是最早的培養材料，Carrel曾長期培養過心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養物，最常用的是雞胚心肌。
心肌比較容易培養和生長，可用懸滴培養、組織塊培養和消化培養法，均可獲良好的效果。取心室肌培養較好，原代培養的雞胚心肌呈紡錘形，培養成功時，一周后可見節律性收縮現象。
五、巨噬細胞培養
巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養，難以長期生存。
巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養中呈巨噬細胞形態和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。
培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法最為實用，其法如下：
1、實驗前三天，向小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內！），以刺流產生大量的巨噬細胞。
2、引頸處死小鼠。
3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。
4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動。
6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。
7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。
8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養基。
9、計數細胞。每只鼠可產生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。
10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。
11、接種數小時后，除去培養液，可去除其它白細胞，純化培養細胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養液置CO2溫箱中。
六、腎小球分離、移植培養
SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡1～2分鐘，2次，置超凈臺內，打開腹腔取出腎臟剪碎，置含Hank’s液的無菌培養皿洗滌，置80目不銹鋼篩網上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產物微小組織透過篩網，濾過組織Hank’s液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網，濾過，去小組織塊，濾過物吸至
200目不銹鋼篩網，輕輕濾過，Hank’s液洗滌1次，收集網上腎小球，鏡下觀察為分離良好的腎小球。腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化20分鐘，加血清終止胰酶反應，離心除去膠原酶。處理過的腎小球計數后接種至24孔培養板或25ml培養瓶，使腎小球大于60個/cm2，加培養基
5～10ml（培養基組成：F12—3T3上清1：1；5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素5μg/ml；25ng/ml氫化可的松；5μg/ml轉鐵蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素0.02ng/ml；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養8～10天，去除腎小球未生長組分，細胞繼續培養24小時，形態學觀察：細胞生長成單層多角型細胞，直徑約100μm。
、裸小鼠移植瘤單細胞分離培養
無菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘，在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質材料以隔斷組織塊與單細胞）來回推動注射器吹打組織以分離單細胞，終止酶消化方法同上。常規方法接種培養收獲細胞。
細胞培養的基本內容
常用設備
準備室的設備：
單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品）、儲品柜（放置消毒過的物品）、包裝臺。
配液室的設備：
扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。
培養室的設備：
液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統、低溫冰箱（-80℃）、空調、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。必須放在無菌間的設備：離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4℃冰箱（放置serum和培養用液）。
無菌操作
無菌室的滅菌：
1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5％過氧乙酸擦拭。
2.CO2孵箱（培養箱）滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射。
3.實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統各20-30分鐘。
4.實驗后滅菌：用75％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。
實驗人員的無菌準備：
1.肥皂洗手。
2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋。
3.用75％酒精棉球擦凈雙手。
無菌操作的演示：
1.凡是帶入超凈工作臺內的酒精、PBS、培養基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。
2.靠近酒精燈火焰操作。
3.器皿使用前必須過火滅菌。
4.繼續使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。
5.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。
6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。