實驗方法原理 微絲普遍存在于多種細胞,對細胞的形狀和運動有一定作用。細胞松馳素B可與微絲的亞單位肌動蛋白結合,從而破壞微絲,改變細胞的形狀
實驗材料 成纖維細胞
試劑、試劑盒 PBSTriton X-100M-緩沖液戊二醛固定液考馬斯亮蘭染液細胞松馳素BDMEM
儀器、耗材 光學顯微鏡鑷子平皿載片吸水紙恒溫箱
實驗步驟
一、方法
1. 在平皿中有三張成纖維細胞貼壁生長的蓋片,在超凈工作臺內將一張蓋片移入另一皿中繼續培養,用作對照。
2. 在有兩片的平皿內加100 μg/ml 的細胞松弛素B 4滴繼續培養半小時。
3. 將用細胞松弛素B處理過的兩張蓋片取一張做染色處理,另一張用培養液洗五次(在平皿內換五次培養液,每次都要搖動),繼續培養、觀察。兩小時后細胞形狀恢復,接近正常。
4. 對恢復的蓋片與第一張沒用藥的蓋片一同做染色處理。
5. 染色處理
(1)將需染色的蓋片放入盛有PBS的平皿內用吸管輕輕吹洗蓋片,換液三次,每次3分鐘,洗去培養液。
(2)將蓋片移入2%Triton X-100液,置37℃恒溫箱內處理20~30分鐘,以提取骨架以外的蛋白質,使骨架圖像清晰。
(3)立刻將蓋片移入M-緩沖液,換洗三次,每次3分鐘。M-緩沖液有穩定細胞骨架的作用。
(4)將蓋片移入3%戊二醛固定15分鐘。
(5)將蓋片移入0.2%考馬斯亮蘭染液中,染色15分鐘。然后小心地用自來水沖洗,空氣干燥。
二、結果
1. 光鏡觀察,微絲聚集成的張力纖維束被染成藍色。
2. 在沒用藥的標本上,成纖維細胞多數有突起,微絲沿突起規則排列。
3. 用細胞松馳素B處理的標本,由于微絲被破壞突起縮回,多數細胞形狀變圓。
4. 用藥處理后又洗去藥的標本,由于解除了藥的作用,肌動蛋白重新聚臺形成微絲,細胞形狀恢復正常。