細胞技術專題：兔膀胱平滑肌細胞培養實驗（三）

1. 應嚴格無菌操作。

2. 仔細徹底剝除膀胱黏膜、黏膜下及漿膜層，是確保獲的大量高質單個膀胱平滑肌細胞的基礎。

3. 膀胱平滑肌組織應盡量減碎以確保充分消化。

4. 嚴格控制膠原酶和胰蛋白酶的濃度和消化時間，見消化液混濁、組織塊呈絮狀，或在倒置顯微鏡下見消化液中有較多單個細胞或細胞小團塊時即終止消化。

5. 細胞篩的運用也是獲得高質單個膀胱平滑肌細胞的基礎。

一、實驗討論

平滑肌細胞的培養方法可分為兩類：組織塊法和酶消化法。組織塊法適用于細嫩、易碎的組織；其方法較簡單；但容易產生雜質如成纖維細胞等，成纖維細胞生長快，故培養之細胞質量較差；培養的大多數細胞無收縮性；且原代細胞的獲得需 3-4 周，獲得大量平滑肌細胞耗時長^[1]。既往酶消化法較組織塊法復雜、精細；適宜的酶濃度和培養時間的確定較為困難；然而在較短時間內可獲得大量的平滑肌細胞，1996 年Chambers等^[2]報道酶消化法純度為70%。可見一種快速、高效、高純度的酶消化法培養膀胱平滑肌的方法顯得尤為重要。

本實驗研究兩只兔所有標本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細胞24 小時均可見膀胱平滑肌細胞貼壁生長，正常兔7 天左右、而梗阻兔則需10~12 天可于50ml 培養瓶約 80%匯合。

均傳代順利，傳代后約正常兔6 天左右、而梗阻兔需8~9 天可于50 ml 培養瓶約80%匯合。

本組中均傳至第8 代，經第8 次傳代后，平滑肌細胞仍生長迅速，未見衰老跡象。

倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結構。

細胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細胞細胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細胞核型。

電鏡檢查可見平滑肌細胞密班結構。免疫組化染色檢測α-SMA呈陽性反應。

從細胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測α-SMA呈陽性反應中我們發現該方法所的膀胱平滑肌細胞的純度幾乎 99%(在以下的膀胱平滑肌細胞的共聚焦檢測中也證實了這一點)。

膀胱平滑肌的鑒定^[3]主要根據其細胞形態及α-actin的檢測。

倒置顯微鏡下觀察均呈“谷 和峰”樣結構；細胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細胞細胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細胞核型；電鏡檢查可見平滑肌細胞密班結構，這些細胞形態學的檢測均證實其為膀胱平滑肌細胞。

免疫組化染色檢測α-SMA呈陽性反應更進一步證實了該方法所獲得的細胞為膀胱平滑肌細胞。

梗阻后的膀胱平滑肌細胞在生長擴增中明顯較正常膀胱平滑肌細胞 時間長，說明了這種酶消化法對膀胱平滑肌細胞的影響不是太大，還是保留著體內的基本特性。

在我們的激光掃描共聚焦顯微鏡的檢測中平滑肌細胞內的鈣離子熒光強度在M受體激動劑的影響下發生明顯變化，這更進一步證實了該方法分離培養出的膀胱平滑肌仍保持著收縮功能。

二、參考文獻

1. Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and their interaction with biopolymers. J Pediatr Surg, 2003,38(1):21-24.

2. Chambers P,Neal DE,Gillespie JI. Ca²⁺ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder.Exp Physiol,1996,81(4):553-564.

3. ChamLey   CJ,Campbell   GR,Ross   R.The   smooth   muscle   cells   in   culture. Physiol   Rev,1979,599(1):1-61.

4. Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca²⁺ channels in human detrusor smooth muscle. BJU Int,2003,92(4):476-478.

5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. J Urol, 2001,165(2):627-632.