細胞株若受到細菌、真菌、支原體、或是特定病毒等之污染時，會嚴重的影響實驗的結果。而細菌、真菌等之微生物污染時，較易自培養基等的外觀變化察覺。但是若受到支原體之污染時，細胞之外觀較無明顯變化，但是其污染會造成細胞之生長速率緩慢、細胞產生病變之型態改變等等變化。
各國細胞庫支原體污染的統計表，如下：
國家 受支原體污染(%) 報告年度
USA－FDA 15 1993(past 30 years)
USA－ATCC 15-20 1992
Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987-19931998
Germany－DSM 36 1990-1994
Argentina 65 1987
Israel 32 1986-1993
China 95 1990
造成支原體高污染率的原因為：
1、支原體size 0.1~0.8 um，無細胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 um）
2、支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學顯微鏡可觀察到的特征變化
3、過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式
4、細胞流通間缺乏品管，造成實驗室間的相互污染
5、研究或操作人員忽略污染問題
支原體污染了來源：
1、已受污染的細胞
2、操作人員的疏失
3、已受污染的培養基、血清
4、操作環境不良、實驗器具不潔等
由于支原體為人體口腔中之正常菌叢，實驗室之操作人員的污染亦可能為污染源，須十分注意。而萬一細胞已受支原體污染時，最佳的處理原則為將細胞高壓滅菌后丟棄，以免污染其它潔凈的細胞株。但是若是堅持要作去除支原體污染，有以下幾種方法，只不過結果會與原始的細胞特性有差異。
去除支原體污染：
1、抗生素處理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
3、Anti-sera
預防與控制方面可從以下各點加強注意：
設備方面：
1、使用已作支原體測試ok之細胞株
2、于另一隔離之區域操作未知是否有支原體污染之細胞
3、使用不添加抗生素的培養基培養細胞
檢測方面：定期以標準的支原體檢測方法檢測細胞、培養基、血清、ddH2O有否被支原體污染。
實驗操作人員之無菌觀念與無菌操作技術之要求
有關支原體污染之問題與回答：
1、應如何避免細胞污染？
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原體。 主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。 嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。
2、如果細胞發生微生物污染時， 應如何處理？
直接滅菌后丟棄之。
3、支原體 (mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。 除極有經驗之專家外， 大多數遭受支原體污染的細胞株， 無法以其外觀分辨之。
4、支原體污染會對細胞培養有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數，代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為 mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。
5、偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？
直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。
支原體之檢測：
直接培養法
原理：直接培養支原體于培養基中，觀察其生長及菌落生成。
特點：是目前最直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標準步驟。
缺點：培養時間長，須3－5星期才能判斷。有些支原體不能在培養基培養出來 (例如M. hyorhinis)。需同時培養支原體株作為正反應對照組，可能會造成污染。
材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養箱、厭氧缸（厭氧缸長期培養易有污染，所以厭氧包應用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內壁。）
培養基制備：
基本配方為Difco PPLO broth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培養時間長，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培養基中以防止其它細菌污染。
· 10x stock solution (1 liter) ：稱取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸餾水中。以0.22μm無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
· 液體培養基 (1 liter) ：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121℃，15分鐘。待溫度降低至室溫后，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均勻后，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存于4℃，期限1個月。
· 固體培養基 (1 liter )：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121℃，15分鐘。放在50℃水中浴中，待溫度降低至50℃時，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stock solution，混合均勻后，倒入60x50㎜之無菌培養皿中，5ml/培養皿。保存于4℃，期限1個月。
步驟：
· 取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，接種于液體培養基中，置于37℃培養二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養一周及二周后，分別取0.1 ml液體培養液涂在agar plate上，將其倒放置于37℃厭氧箱培養，培養至少3星期，持續觀察是否有支原體之菌落出現。
· 另取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，涂抹在agar plate上，37℃厭氧培養3星期，持續觀察是否支原體菌落出現。
· 另作正負反應對照組，正反應對照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負反應對照組為待測細胞之新鮮培養基。
結果判讀：
· 支原體生長較慢，所以先在液體培養基培養1~2周增殖后，再培養于agar plate上。需至少培養3星期后，才可斷定是否有支原體污染。所以整個測試需5個星期才知正確結果。
· 典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原體往agar下層生長所致，為圓形無色透明菌落，大小約10-55μm。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態（slime）。
· 若要區分細胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養于液體培養基中，培養一星期后再種入agar plate，若是細胞則不會生長。