支原體菌株來源：
M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原體
M.FermentaneATCC19989 發酵支原體
M.SalivariumATCC23064唾液支原體
M.HominisATCC23114人型支原體
M.OraleATCC23714口腔支原體
M.HyorhinisATCC29052豬鼻支原體
其共同引物序列來自16s和23s保守區域，外部引物為Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，Ｒ1
5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；內部引物為 Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，Ｒ2
5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。
ＰＣＲ反應體系和條件：10×緩沖液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明膠)、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的濃度為2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蠟油覆蓋。反應溫度和時間為:94℃
/2ｍｉｎ預變性、94℃/30ｓ變性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸,循環30次后72℃延伸5ｍｉｎ。第1次ＰＣＲ反應取模板
10μＬ,第2次ＰＣＲ反應以第1次ＰＣＲ擴增產物為模板取1μＬ。
下面是更詳細的：
污染測試——支原體：PCR方法
原理： 利用具特殊專一性之primers，經由PCR反應來復制mycoplasma
DNA。所用之primers來自mycoplasma之conserved 16S-23S
rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma種類不同而不同，因此可依所復制之DNA大小及其restriction
fragment大小差異來作偵測與鑒定。
特點：靈敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 與快速(一天)。可偵測不易培養之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培養mycoplasma作為正反應對照組，避免可能之污染。
缺點：PCR反應很靈敏，易有偽陽性結果。此方法尚在評估中，故結果僅作為參考和內部品管之一部份。
材料與設備：
ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.
提供1st stage primer mixture與2nd stage primer mixture
positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)
PCR reagents :
Taq polymerase ( 5 U / ul )
dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )
10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)
25mM MgCl2
sterile ddH2O
Machine / Equipment：
PCR thermal cycler
agarose電泳設備
DNA電泳膠體觀察設備
無菌 PCR反應管
無菌1.5 ml微量離心管
無菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans
方法： 此PCR反應是一種nested PCR，包括2階段PCR反應，1st stage PCR結束后，取其反應物作2nd stage
PCR，然后取2nd PCR產物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結果。
結果：使用UV light觀察，并照相記錄。
不過應用較多還是巢式PCR
方法：此PCR反應是一種nested PCR，包括2階段PCR反應，1st stage PCR結束后，取其反應物作2nd stage
PCR，然后取2nd PCR產物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結果。
結果：使用UV light觀察，并照相記錄。
方法再詳盡點：st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：
測試樣品 ( 2 ul / each )
直接取樣測試細胞之培養液。
Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )
Negative control : ddH2O
Reaction mixture ( 23 ul / each )
10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
1st stage primer mixture 0.5 ul
dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l
MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul
ddH2O 18.4 ul
PCR program ( 1st PCR與2 nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler
step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min
step 4 : extension: 72 ℃ 2 min
重復3.1.3.2至3.1.3.4步驟30 cycles
step 5 : final extension 72 ℃ 5 min
2 nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）
測試樣品：1st stage PCR product（1 ul / each）。
Reaction mixture ( 24 ul / each )
10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
nd stage primer mixture 0.5 ul
dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul
MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul
ddH2O 19.4 ul
PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler
膠片電泳分析
膠片 (2.0%) 置備: 將2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。
電泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）
選擇100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )
取10 ul 2 nd stage PCR產物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。
進行電泳分離100V, 25 min。
膠片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr為致癌物質，請戴手套并小心操作）
結果：使用UV light觀察，并照相記錄。
Figure Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from
eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from
ATCC mycoplasma detection kit)