細胞爬片全過程經驗總結

1.  爬片可用一般的蓋玻片，也可用爬片； 
2.  應用蓋玻片，可根據自己的需要剪裁成合適的大小，以備置于 6 孔板、12 孔板或 24     孔板；裁剪時可用前護士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪，或者是口腔科的那種小沙輪，輕輕劃一下后，稍用力一掰就分開了。 如果接種大皿的話，我一般不將蓋玻片切開，直接清潔后放入培養皿中，到染色時再將之切 開，這樣既保證了細胞均一性，又可同時做幾個指標的染色。 
3.  將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗 20 遍，再置于無     水酒清中浸泡 6 小時，再用三蒸水沖洗 3 遍（個人認為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養皿中烘干后進行高壓消毒。 
4.  高壓后取出放入烤箱中烤干，備用。烤干后可放入超凈臺中。 
5.  關于多聚賴氨酸，很多人都將玻片用此處理，以使細胞與玻片結合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸，細胞貼壁仍然很好，且在做后續的免疫細胞化學染色、TUNEL     等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。  

【細胞爬片】
1.  胰酶消化細胞后計數重懸細胞于完全培養基中。 
2.  加細胞時，根據玻片的大小，先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養基，目的是使     玻片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起，造成雙層細胞貼片。整個過程注意無菌操作。 
3.  根據自己的需要選擇合適的細胞密度種入培養板內即可 4.  待細胞貼壁后，可去上清加含藥培養基。 
5.  按照實驗設計，作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養皿底結合較緊，張力較大，我一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出 就可以了。如果要做諸如 24h，48h，72h等這樣時間點的實驗的話，將所需數量的爬片取出時應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續培養。  

【細胞爬片的固定】 細胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。當然，根據研究目的，PBS洗也不是 一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗，因為凋亡的細胞在洗的過程中有可能會 脫落。 另外在保存細胞爬片的時候，我一般用培養皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬 片，這樣方便做實驗時取片。然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標記，為避免混淆，可用透明膠 帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存 2-3 個月的片子做免疫組化是沒有問題的。  

以下為常用的固定液 
1.  冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。 將純的丙酮預先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮（放心，丙酮在此溫度不會為固體的）細胞爬 片取出后，PBS洗 2 遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很強的揮發性，注意將含有丙酮 和爬片的器皿蓋嚴，防止其揮發）固定 10 分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。 

2.  多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇 (CD)、主要組織相容性抗原等 室溫固定 15 分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存。 
3.  95％乙醇，可用于免疫組化。 
優點：穿透性強、抗原性保存較好。 缺點：但醇類對低分子蛋白質、多肽及胞漿內蛋白質保存效果較差，使蛋白變性的作用輕， 固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度 室溫固定 15 分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存 

4.  甲醛(福爾馬林)應用zui廣 優點：形態結構保存好，且穿透性強， 缺點： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； 分子間交聯形成的網格 結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果。 室溫固定 15 分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存 。