4. 細胞離心分離過程中常常遇到的一些問題
i. 細胞聚集：
細胞聚集后在離心過程中的沉降行為與單個細胞完全不同，因此出現細胞聚集會影響分離純度。避免的方法是添加一些防止粘結的成分如小牛血清白蛋白，脫氧核糖核酸酶（D Nase ，防止膠結）、蛋白酶（protease ）、EDTA 等；（參考文獻6）
關于離心分離溫度，有些論文設在4℃離心分離細胞效果很好，也有人認為初步分離時溫度應保持在20℃以上。（文獻7）
ii. 在梯度液中細胞過載：
在密度梯度離心中，每種細胞的數量都不能超過對應于它的密度的梯度液的容量， 也就是每種細胞在梯度液中所占有的梯度層的厚度是受限制的，過分厚的純樣品區帶會與別的細胞的純樣品區帶相重疊；這是問題的一方面。另一方面，雖然垂直管轉頭在高速離心時，它的離心管縱切面可以容納更多的樣品分子（與甩平轉頭的離心管橫剖面相比較），但在離心完成、梯度從垂直方向轉換到水平方向后，每個純樣品所占據的離心管中心軸上的寬度很大。如果初始樣品中所含的細胞品種很多，純化后也會造成純樣品帶的重疊。關于這個問題沒有精確的數學計算，全靠用戶在實驗中逐漸積累經驗。這涉及待分離樣品中細胞的濃度，和梯度離心時的加樣量（2％～5％離心管容量）以及梯度的形狀（梯度曲線的斜率，連續梯度或者階梯梯度）等等。
iii. 壁部效應：
在角式轉頭中沿離心力方向沉降的細胞接近離心管壁部時，與在離心力分力作用下沿管壁下滑的細胞碰撞，造成在角式轉頭離心管近外壁部形成了一個“壁部效應區”，這個壁部效應區從離心管上部到下部逐漸加寬。由于壁部效應，可能會造成部分細胞的聚集而影響分離純度，也可能有一小部分細胞由于碰撞而受損。這種影響在用固定角式轉頭作等密度離心時尤為顯著。所以細胞離心分離除浮選轉頭外一般小容量選擇甩平轉頭，大容量選擇區帶轉頭。
iv. 旋渦效應：
在加速或減速過程中在離心管中產生的小旋渦會影響梯度的完整，在減速過程中還會影響已被分離的純樣品帶的寬度，轉速500rpm～1000rpm 之間往往在復合向心力、也就是Coriolis 力的作用下在離心管中會產生渦旋，渦旋在下列情況下可以減少：
l 增加回轉半徑；
l 慢加速和慢減速（根據不同轉頭，不同容量，不同離心方法可以多檔控制的加、減速速率）；
l 縮小離心管直徑（∮10mm 以下，這在大多數情況下不現實）；
l 使用一些抗旋渦的緩沖液（文獻5）；
l 應用有較陡斜率的密度梯度。
v. 液滴效應：
在預形成密度梯度液上表面加待分離的細胞樣品，如果不馬上離心，就會有很少的液滴滴入梯度層。這個現象在加樣后幾分鐘內會發生，其結果是在樣品與梯度液的界面上出現層間擴散（文獻8）而影響分離效果，減少這種影響的方法是
l 降低樣品濃度；
l 提高梯度液的初始斜率；
l 在鋪完樣品后立即放入轉頭并開始離心分離。
vi. 離心力的選擇：
離心力選擇不當會影響細胞活力改變、細胞的內部構造、影響細胞的裂介和復制。這種影響常出現在：
l 長時間的離心分離過程；
l 轉頭的快加速；
l 過大的離心力產生了較大的流體靜壓；
l 應用較高轉速的等密度離心法。
如果我們選用較低的轉速，粘度較小的梯度材料（本講座文獻18）；利用細胞浮選轉頭等都可以減少這種影響。
vii． 滲透效應：
很多細胞特別是哺乳動物細胞沒有堅固的細胞壁，周圍的介質很容易滲透到細胞內部或者細胞內液體反向滲透到周圍介質中而引起細胞的膨脹和收縮，從而改變離心過程中細胞的沉降（或上浮）特性。因此配制等滲的梯度液是必要的（講座文獻18）
（二）實用細胞離心分離方法舉例
（1） 血細胞純化：
血細胞由多種類型的但細胞懸液組成，每種細胞都有它們自身的特性和功能并廣泛被用于醫學臨床和診斷。多年來研究人員對血細胞分離純化作了大量工作，實驗室研究和血液成分分離都已廣泛使用各種離心設備，如用于醫學臨床分析、診斷的全自動血細胞洗滌離心機（Hitachi MC-450,24 管，Sorvall CW-2,12 管），用于大量血液（標準200ml，300ml，400ml,500ml 三聯或四聯血袋）成分分離用的大容量低速、低溫離心機（參考技術講座文獻1）等等。下面我們將以實驗室研究為主線，舉例說明各種血細胞分離純化方法。
由B∮yum 研發并在多年來被普遍應用的血細胞純化方法是用梯度材料Na-metrizaate 與Ficoll 的混合液作密度梯度離心，把血球中的紅血球，多形核細胞、淋巴細胞、單核細胞、血小板分離純化。這種溶液有不同的商品名稱如Lymphoprep（Nycomed Pharma 公司）、Ficoll －pague （pharmacia-Biosystems 公司）等，都可以作這一用途。（文獻9）
下面的例子是在室溫下用低速離心機作血細胞分離的實驗。
例1．人血中單核（白）細胞的純化
i. | 用抗凝血劑處理血樣，常用抗凝劑為0.32％檸檬酸鈉。 |
ii. | 用等容積的生理鹽水稀釋血樣。 |
iii. | 在10ml～15ml 離心管中先注入3ml metrizoate-Ficoll 分離液，在其上鋪6ml 已稀釋 |
血樣。 | |
iv. | 用甩平轉頭600g（1,800~3,000ropm，臺式機）×20 分，20℃。（ 不要在4—5℃低 |
溫離心，否則分離效果將很差。 | |
v. | 離心后用巴氏移液吸管從血漿與分離液界面中間吸出血細胞層，其中含有單核（白） |
細胞和部分血小板。 | |
vi. | 加入幾毫升生理鹽水，降低收集的血細胞濃度。 |
vii. | 同一離心轉頭，同一離心管250g（1200rpm 左右）×5 分鐘20℃。可以用同一工 |
藝在離心機中洗幾次。 | |
viii. | 收集沉淀在生理鹽水中保存。 |