細胞的離心分離基礎和分離實例（五）

例4：肝細胞的不連續密度梯度分離

這種方法適用于從肝竇狀細胞（Sinusoidal）中除去紅細胞和主質細胞（parenchymal）,離心結果是讓紅細胞沉淀，內皮細胞（Sinusoidal）浮上。

實驗需要的基本設備和溶劑：

l  一臺帶甩平轉頭的低速、低溫離心機；

l  GBSS；

l  在無NaCl的GBSS中的28.7% Nycodenz或 30% metrizamide

l  15ml塑料離心管；

l  竇狀（Sinusoidal）肝細胞；

l  Trypan藍染色劑；

l  過氧化物酶染色劑，及染色需要的設備；

l  生理鹽水（0.9% NaCl）；

l  固定液：2.5%戊二醛在0.1M二甲基胂酸鈉中（PH7.4）（二甲基胂酸鈉有劇毒，可用0.1M磷酸鹽代替）

l  培養液：（在通風柜或生物安全柜中配置）

9.5ml 1.0M NaCl；

         11mg 1-乙酸萘脂在0.5ml乙基乙二醇-乙醚中（在氮氣中保存）；

         0.5ml 1.0M NaCl；

          0.25ml 4% 品紅在2.0M HCL中，0.25ml 4% 硝酸鈉在純水中，共計0.5ml混合；

          把以上混合液調節到PH7.4，纖維紙過濾后待用；

         注意：30分鐘內用完！

離心方法：

      i. 準備10ml Sinusoidal肝細胞在GBSS中懸液（1～4×10⁸個細胞）；

      ii. 在懸液中加14ml28.7%（W/V）Nycodenz 或30%（W/V）metrizamide 輕輕混勻；

      iii. 將以上溶液分別注入二個離心管，并在每管液面上緩鋪1-2ml GBSS；

iv. 離心：400gx15分，室溫，不用剎車，自由滑行減速至停轉；

      v. 從GBSS 與梯度液之間慢慢地抽吸Sinusoidal 細胞

      vi. 用例2 同樣的方法測定細胞數量和活力。

      vii. 酯酶染色反應

      l  數滴細胞懸液（～0.5×10⁶ 個細胞）滴入1～2ml 固定液，4℃，7 分鐘

      l  700g×3 分，低速離心后，去上清，沉淀用0.9％Nacl“洗”二次（在離心機中，700g×3

      分“洗”2 次）

      l  取“洗”后沉淀與200μl 0.9％ Nacl 作成懸液，加入等容積培養液，37℃培養染色10 分

      鐘

      l  用血球計數器測定染色百分比：Kupffer, endothelial 及Parenchymal 細胞染成紅色，紅

      細胞及淋巴細胞不被染色，儲脂細胞微染。

      l  結果可用下表表示

例5：用雙階梯不連續梯度部分純化儲脂細胞，需要的設備和化學試劑同例3。

      i. 從一只成年雌鼠取肝制成Sinusoidal 細胞懸液（1～4×10⁸ 個細胞在12ml GBSS 中）

      ii. 以6 倍容積的28.7％（W/V）Nycodenz 或30％（W/V）metrizamide 配以4 倍容積的

      GBSS 來稀釋梯度液。取二個離心管（15ml），每管注入5ml 已稀釋的梯度液（17.2％

      Nycodenz 或18％metrizamide）

      iii. 將8ml 未稀釋的梯度原液與12ml 細胞懸液i 輕輕混合，混合后溶液中梯度液濃度為

      11.5％Nycodenz 或12％metrizamide

      iv. 每個離心管液柱上鋪5ml 已稀釋的細胞懸液與梯度液（iii 液），再在液面上鋪1～2ml

      GBSS 形成雙階梯不連續密度梯度。

      v. 低速離心1400g（2,700~2,800rpm）×17 分，20℃，無剎車，自由滑行至停轉。

      vi. 用吸管從二個離心管的低密度界面及高密度界面上分別抽出細胞層。

      vii. 用與例3 同樣的方法測定細胞產率、活力及組成并作成下表：