2、改良了傳統SIM方法產生衍射光柵的方法
2D-SIM成像需要通過產生兩束互相干涉的光來形成三種不同偏振方向,且光強在空間上呈正弦變化的結構光。在傳統的SIM成像方法中,這一過程除了要依靠液晶硅基的空間光調制器(LCOS-SLM)對光相位進行調制之外,還需要一種特殊的光學器件來改變光的偏振方向——旋偏器(polarization
rotator)。但這個器件本身的響應時間是ms數量級的,所以成為了高速SIM成像的一個限制因素。
而陳教授團隊自主設計了新的偏振旋轉玻片陣列,使其可以更好的配合SLM和相機曝光,使得激發光的偏振方向做最快速的切換。

圖中PR所示部分即旋偏器,b中上下兩部分的雙向箭頭分別表示入射光和經過旋偏器后光的偏振方向。
3、極大程度的降低圖像采集和重構過程中產生的Artifact
我們都知道在SIM方法中,算法重建也起著相當重要的作用。但是在解卷積的算法中,計算機或者說軟件對信號和噪音的解讀是“一視同仁”的。換句話說它很難自己告訴自己哪些地方是信號,哪些地方是噪聲。
所以,為了將SIM成像的低光漂泊和光毒性優點發揮到極致,不得不克服在弱光低信噪比情況下算法所重建出來的Artifact。為了應對相應的問題,譚山教授團隊提出了一種能夠基于生物樣品結構相關的先驗知識來屏蔽噪音信號的重建算法——Hessian解卷積算法。

這個就是Hessian解卷積算法的最優解形式,以及其中的Hessian罰分矩陣(別問,小編也不懂??扶額.jpg
我們知道,樣品信號除了在xy平面上具有連續結構之外,當其每一幀的運動距離小于系統空間分辨率時,它在xyt的時空上也是連續的。相反,背景噪聲在重建后形成的Artifact則是時空分布隨機和無特定形態的,因此通過這一標準就可以很好的去除這些Artifact。
通過比較Hessian解卷積算法和其他幾種經典和常見的SIM重構算法(如Wiener、TV-SIM、fairSIM等),發現高速記錄時的低信噪比圖像在使用除Hessian之外的算法進行重構之后,均會有不同程度的Artifact產生(同樣的情況在長時間激發引起的光漂泊現象中也能夠觀察到),而Hessian算法的表現則一如既往的好。

不同SIM解卷積算法重建超分辨圖像的效果對比:樣品為Lifeact-EGFP標記的微絲,曝光時間為0.5 ms,每組左圖為0 s時刻的圖像,右圖為60 s時刻的圖像。
此外,該系統也擁有超高的時間分辨率,并達到了188 Hz的幀速。有著這樣的性能表現,其關鍵硬件——相機則應實現9倍以上的采集速度。
使用了第二代前照式sCMOS芯片,可在512×100的分辨率下進行2000幀/s的采集——作為目前科研領域最高速的CMOS相機,濱松sCMOS ORCA-Flash4.0 V3便是該系統的選擇。
雖然使用前照式芯片是保證成像速率的必要之舉,但是也并沒在靈敏度上大打折扣。濱松Flash4.0相機具有業內最低的讀出噪音(0.8 e-),同時82%的高量子效率,可保證在低曝光時間的條件下得到相對高的圖像信噪比。
針對現在流行的超分辨成像技術,其相機芯片也做了更加精細的定量校準,將像素之間的光響應差異(PRNU)和噪音的不均一性(DSNU)都降到最低。
值得一提的是,Flash4.0輸出的圖像一直以來都是未經任何處理的原始圖像,不在原始數據層面對噪音或hotpixel進行插值或濾波。這樣在輸入到各種重建或擬合的算法模型中才能得到準確的結果,避免了再人為引入其他Artifacts。

通過硬件創新和算法優化以及精確的時空信號控制,Hessian-SIM可以在低于傳統SIM激發光功率的條件下,以更低的曝光時間進行圖像采集,并對樣品的原始信息高度還原。從而實現對細胞內瞬時變化的高速連續記錄,或者對活細胞內部結構的長時觀察。

在相同的光照條件下,以1 Hz頻率進行拍攝1 h,傳統SIM使用7 ms曝光,而Hessian-SIM使用0.5 ms曝光。
陳良怡教授團隊一直致力于對高端的生物成像技術進行革新性的改良和研發。除了解決超分辨成像的長時間或高速問題之外,早在2014年就與程和平院士就將雙光子和光片成像技術結合開發出激發光片范圍更大同時z軸分辨率更高的成像技術(Zong
W, Chen L, et al.CellRes. 2014 Sep 26. doi:
10.1038/cr.2014.124);2017年又針對雙光子在神經生物學應用中的靈活性,開發出了現今質量最小的頭戴式微型雙光子顯微鏡(Zong
W, Wu R, Li M, ChenL, et al. Nat Methods. 2017 May 29. doi:
10.1038/nmeth.4305),解決了行為學和活體顯微觀察的矛盾。