4.rDNA片段的制備
(1)對所得重組質粒DNA進行SacⅠ酶切，反應體系如下：SacⅠ 4μl(約20單位)，質粒DNA 50μl(20μg)，10×緩沖液(0.5mol/L Tris-HCl，pH7.5，50mmol/L MgCl2)10μl，滅菌重蒸水36μl。
(2)將反應后的混合物進行瓊脂糖凝膠電泳2-3h，在紫外燈下確定DNA片段的位置，從凝膠上切下相應DNA片段的凝膠塊。
(3)將上述凝膠塊裝入透析袋中，一端扎緊，加入450μl 0.2×TEB(10mmol/LTris-HCl，pH7.5，1mmol/L EDTA)，排除氣泡，封上另一端。放入電泳槽中進行電泳，300V電泳1.5h，反向通電1min。
(4)從透析袋中吸出溶液，再加450μl 0.2×TEB沖洗透析袋，兩次溶液合并后以12000rpm離心15min，除去凝膠碎塊。
(5)用酚、酚/氯仿、氯仿抽提后，加入2倍體積乙醇，沉淀DNA片段，再用70%乙醇洗滌并真空干燥，用TE溶解待用。
5.rDNA片段的生物素標記
本實驗用的標記方法是缺口平移法(Nick-translation)。其原理是在未標記的DNA探針溶液中加一定量的DNaseⅠ和DNA聚合酶
Ⅰ以及生物素(或同位素)標記的三磷酸核苷酸。DNaseⅠ在DNA雙鏈上隨機切開若干個有3'-OH末端的單鏈切口，DNA聚合酶Ⅰ則利用標記的三磷酸核苷酸按5'
-3' 方向重新修補缺口，此新合成的DNA的兩條鏈上均勻地被帶上標記物。其標記方法如下。
(1)反應體系
10×生物素反應液：0.5mol/L Tris-HCl,pH7.5，50mmol/L MgCl2。
dNTP溶液：50mmol/L Tris HCl，pH7.5，每種dNTP的最終濃度為0.3mmol/L。
生物素化dUTP溶液：Bio-dUTP溶于50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，最終濃度為 0.3mmol/L。
DNA多聚酶Ⅰ溶液；濃度為3單位/μl，溶于0.1mol/L磷酸鈉，50％乙醇，l mmol/L DTT混合液中。
DNaseⅠ溶液：濃度為0.1μg/μl，溶于10mmol/L Tris-HCl，pH7.5，l mg/ml 牛血清白蛋白混合液中。
(2)取dNTP混合液(無dUTP)5μl，10×反應液5μl，DNA 4.5μl(1μg)，Bio-dUTP 7μl，酶混合液5μl，重蒸水23.5UI。混合后反應60rain，加5rd終止反應液(0.25mo1/L EDTA，pH7.5)終止反應。
(3)加入2倍體積的乙醇，沉淀DNA。
(4)用70%乙醇洗滌3次，以除盡來摻入的Bio-dUTP。
(5)真空干燥之后，以重蒸水溶解DNA，待用。
6.對標記的rDNA進行檢測
采用硝酸纖維素膜固相雜交的方法進行檢測。
(1)將硝酸纖維素膜剪成合適大小的長條，在2×SSC(0.15mol/L NaCl，0.015mol/L檸檬酸鈉，pH7.4，等于1×)中浸泡過夜。
(2)撈出硝酸纖維素膜，空氣干燥。
(3)將標記后的探針進行適當稀釋，95℃水浴加熱2-5min，使DNA變性。
(4)將變性后的DNA探針馬上冰浴10min。
(5)將探針點在晾干的硝酸纖維素膜上，每個斑點點4μl。
(6)晾干后，將點樣的硝酸纖維素膜夾在濾紙中間，80℃烘烤2h。
(7)用0.01mol/L PBS，pH8.2洗滌3次，每次15min。
(8)將與膠體金相連的鏈霉親和素用pH8.2的PB進行稀釋，并將膜放入該液中，室溫孵育60min。
(9)用0.01mol/L PB，pH8.2洗膜3次，每次15min。
10)顯影。
A液(對苯二酚0.85g，檸檬酸2.55g，檸檬酸鈉2.35g，水50ml)B液(AgNO3 93mg，水50ml)按1：1混勻為顯影液。將膜浸泡在顯影液中，避光顯影至出現深色斑點。用25%海波定影1-2min。
四.原位雜交和雜交子的檢測
1.原位雜交
(1)按電鏡常規制片程序，將用K4M樹脂包埋的玉米根、松根等材料進行超薄切片，將其撈在鎳網上。
(2)將載有切片的鎳網放在2×SSC液面上于700℃浸30min，以破壞rRNA的二級結構。 另取一些切片載網，先用1mg/ml RNase處理2h，用重蒸水徹底清洗。再轉入2×SSC中，于70℃加熱處理30min作對照。
(3)在Parafilm膜上滴25μl預雜交液(50%去離子甲酰銨，10%硫酸葡聚糖，0.05%變性鮭精DNA，2×SSC)，將切片漂浮在預雜交液上，放入保濕盒內，42℃預雜交1-2h，以防止非特異性雜交。
(4)將標記的探針加熱至100℃，變性5min后馬上放入冰水中，0℃冰浴10min。
(5)在預雜交液中加入變性的探針，終濃度約為0.5μg/ml，此液即為雜交液。
(6)將雜交液滴在Parafilm膜上，將預雜交的切片漂浮在雜交液上。
(7)雜交后用50%去離子甲酰胺洗兩次，每次5min。
(8)載片鎳網依次用2×SSC，1×SSC，0.1×SSC，重蒸水各洗兩次，每次5min，空氣干燥。
(9)雜交后的切片用3%BSA(0．1mol/L PBS配制)封閉5min。
(10)將切片漂浮在金標鏈霉親和素上(金顆粒直徑為10nm，1：20稀釋)，于室溫放置1h。
(11)用PBS洗3次，每次5min，空氣干燥。
2.電鏡檢測雜交結果
(1)用1-2%醋酸雙氧鈾染色5min。
(2)重蒸水漂洗3次，每次5min。
(3)檸檬酸鉛染色1min。
(4)重蒸水漂洗同(2)，空氣干燥后電鏡觀察。
該實驗的結果是，在玉米、松的染色體上有金顆粒分布，對照為陰性。