細胞結構成分的離心分離技術2

3、等密度離心法

等密度離心法（isodensity centrifugation）根據Stokes公式，當顆粒密度（ρp）等于介質密度（ρM）時，離心時顆粒懸浮于介質中不移動。等密度離心法就是根據這一原理進行的。采用包括各種顆粒密度范圍的梯度介質，把要分離的樣品放在密度梯度液表面或者混懸于梯度液中。通過離心，不同密度的顆粒或上浮或下沉，當到達與它們相同密度的介質區帶時，顆粒不再移動，結果不同密度的顆粒位于各自的密度區，形成一系列區帶。然后停止離心，從管底收集不同密度的顆粒。

二、細胞結構成分離心分離的實驗方法

（一）實驗條件的選擇

（1）離心方法的選擇 在進行細胞結構成分離心分離時，要根據研究對象選擇離心方法。選擇的依據主要是顆粒的大小和密度以及各種離心方法的特點。如果樣品中顆粒的大小或沉淀系數差別很大，一般采用差速度離心方法就可達到分離的目的；如果顆粒大小差別較小，可用移動區帶離心法；如果顆粒的大小差別不大而密度有差別，則應采用等密度離心法；如果兩種顆粒的大小和密度都相似，就必須通過適當方法改變某種組分的性質，然后進行離心分離。另外，不同方法的特點也是考慮的因素，如差速離心法離心時間比等密度離心法短，而且所用介質濃度也比較低，對細胞結構成分的損傷和抽提都比較小，因此適用于細胞結構成分的分析分離；而等密度離心法在一定體積的介質中可以分離較多的細胞成分，適用于細胞結構成分的制備分離。

（2）介質材料的選擇 理想的介質材料應該是：形成的溶液密度范圍大、粘度低，對細胞結構成分損傷小，離心分離后容易去除，濃度容易測定等。常用的介質有蔗糖、甘油等親水有機分子和氯化銫、硫酸銫等重金屬鹽。蔗糖和甘油溶液的最大密度是1.3×103kg/m3,能用來分離較低密度的膜性細胞器如高爾基體、內質網、溶酶體和線粒體等。重金屬鹽溶液的最大密度可達1.9×103kg/m3，可用來分離密度大于1.3×103kg/m3的分子，如DNA、RNA、核糖體等。由于重金屬溶液密度很大，在離心力場中會自動形成密度梯度，用來分離的物質可直接與重金屬鹽溶液混合，然后進行等密度離心。

（二）細胞器的分離

（1） 細胞器的釋放 在分離細胞器之前必須破碎細胞、釋放細胞器。破碎細胞的方法有低滲處理、超聲振蕩、凍融、用勻漿器打碎等多種細胞勻漿，但最常用的方法還是細胞勻漿，即采用機械方法破碎細胞使其勻漿化，濾去細胞碎片后制成細胞器懸液。

（2）細胞器的初步分離 用差速離心法分離各種細胞器。先用500～1000×g離心，使大的細胞組分沉降，沉淀中主要是細胞核，還包含一些細胞碎片；將第一次離心的上清液用10000～20000×g離心，使中等大小的細胞器沉降，沉淀中包含線粒體、溶酶體和過氧化物酶體；將第二次離心的上清液再用更高的速度（～100000×g）離心，使小的細胞器如微粒體、內質網、高爾基體和質膜沉淀，上清液中剩下胞質溶膠的有關成分。細胞器在每一步離心沉淀中的分布可隨離心速度和時間的不同而有一定差別。一般說來，用差速離心分離的細胞器不是很純的，要獲得比較純的細胞器必須把初步分離的細胞器進一步純化。

（3）細胞器的純化 可采用不同的方法進一步將初步分離的細胞器純化。如線粒體、溶酶體和過氧化物酶體雖然大小相近，但密度不同，可用等密度離心進一步分離；細胞核部分則可用高密度蔗糖溶液（2.0mol/L）的差速離心法來純化。對分離細胞器純度的鑒別主要有兩種方法：一種是電鏡作形態鑒別；另一種方法是生化分析，因為已知每種細胞器都含有某些特殊的分子，可作為標志用于鑒定細胞器（表2-1）。

細胞器分離純化后，一方面可對細胞器的化學組成、酶活性和代謝特點進行分析，另一方面可將分離的細胞器在體外進行該細胞器的功能實驗，稱為無細胞系統( cell free system )實驗。目前有關細胞器結構與功能以及細胞中的重要反應過程的資料，如蛋白質合成機制、蛋白質分選和運輸等，有不少來自分離細胞器的生化分析和無細胞系統實驗。