| 實驗步驟 | 
一、用膠原酶/EDTA 釋放細胞
1. 用預保溫溶液洗滌單層細胞并用膠原酶處理
(1) 預保溫溶液洗滌細胞。
預保溫溶液：
5 mmol/L EDTA 鈉鹽溶于 HBSS，不含二價陽離子。
(2) 在單層細胞上加 1% 的膠原酶溶液，在 37℃ 保溫 30 分鐘，偶爾搖動。
1% 膠原酶：
IV 型膠原酶（Sigma ) 溶解在含 1 mmol/L CaCl2 的 1% 的 BSA/HBSS 溶液中，含 Mg2+，配成 1％ 的膠原酶溶液。溶液經過濾除菌并保存在 -20℃ 直到使用，避免反復凍融。
(3) 加 1 mol/L EDTA 鈉鹽（pH 8)。使終濃度為 5~10 mmol/L。保溫到細胞變圓，通常需要 30 分鐘。
(4) 用臨床臺式離心機 250 g 溫和離心 2~3 分鐘以收集細胞。室溫也可以接受，但最好在 4℃ 進行。開始分離細胞膜之前至少用 HBSS/EDTA 溶液洗滌細胞一次再將細胞均勻地懸浮在小體積（1~2 ml) 的第 2 步中所描述的細胞膜包被緩沖液（PMCB) 中。
2. 準備下列溶液：
30% 的陽離子硅膠貯存液可以根據 Chaney 和 Jacobson (1983) 的方法制備。
3. 取剛剛洗滌過的至少含 5x106 個細胞的來自第一步的單細胞懸液。
4. 用臨床臺式離心機 900 g 離心 2~3 分鐘沉淀細胞，最好在 4℃，溫和地將細胞重新懸浮于 1 ml PMCB 緩沖液中。防止細胞破裂。從此刻到第 9 步，如果發生了細胞破裂，細胞器和細胞碎片可能會與細胞膜一同被分離，這是最大的污染源。
5. —滴一滴地將細胞懸浮液加到 5 ml 1% 的陽離子硅膠 PMCB 溶液中，同時在一個 50 ml 的錐形離心管中輕輕混旋溶液。注意是細胞加到陽離子硅膠中而不是硅膠加到細胞中。所有細胞加完后，用 PMCB 緩沖液稀釋二氧化硅包被的細胞懸浮液到 20 ml。
6. 900 g 離心 3 分鐘沉淀硅膠包被的細胞。棄掉含有二氧化硅的均勻渾濁而不是絮凝狀的上清。沉淀物應該致密而不是蓬松的，如果沉淀明顯呈絮凝狀或蓬松，可能發生了細胞裂解。為了獲得最好的結果，細胞在直到第 7 步的任何一個包被階段，在相差顯微鏡下觀察都應該是完整的。
7. 小心懸浮細胞于 20 ml PMCB，重新于 900 g 離心 3 分鐘沉淀細胞，棄掉上清，再小心懸浮細胞于 20 ml PMCB。最后 900 g 離心 3 分鐘沉淀細胞，將細胞懸于 1 ml PMCB 中。
8. —滴一滴地將重懸的硅膠包被的細胞加到輕輕混旋著的 5 ml 1 mg/ml PAA/PMCB 溶液中，以便用 PAA 過度包被細胞。用 PMCB 將整個懸浮液稀釋到 20 ml。900 g 離心 3 分鐘沉淀細胞，棄掉上清，懸浮細胞于 20 ml。
9. 900 g 離心 3 分鐘沉淀細胞，棄掉上清。
10. 用振蕩器將細胞充分懸浮于 1~5 ml 冰冷的補加了合適的蛋白酶抑制劑的低滲裂解緩沖液中，冰浴 30 分鐘，偶爾搖蕩。
11. 在 Bounce 勻漿器中用緊密配套的研杵裂解細胞，用顯微鏡觀察一小滴溶液以監控裂解程度。如果細胞看起來抗這種處理的裂解，可能必須用 Parr 氣彈的液氮成孔作用 ( Chaney and Jacobs 1983) 或用細胞裂解器來機械裂解。
12. 分離裂解物以獲得細胞膜。
(1) 一步分離的方法
① 用等體積 100% 的 Nycodenz 稀釋細胞裂解物，將獲得的含 50% Mycodenz (比重 1.25) 的稀釋物鋪到 5 ml 離心管中的 0.5 ml 70% Nycodenz 溶液（比重 1.37) 上用裂解緩沖液加滿離心管，裂解緩沖液中的溶質通常使其比重為 1.03。
② 在吊桶式轉頭（如 Beckman, SW60Ti) 中 60000 g 離心 20 分鐘沉淀細胞膜。
③ 陽離子硅膠包被的細胞膜出現在管底的沉淀中。細胞核和完整的硅膠包被的細胞在 50%/70% Nycodenz 的交界面，細胞質蛋白通常懸浮在 50% Nycodenz 溶液中，內膜通常漂浮在 50% Nymdenz 與裂解緩沖液的交界面。如果要從 50% Nycodenz 與裂解緩沖液的交界面收集內部蛋白，可以用 4 倍體積的裂解液稀釋后 60000 g 離心 60 分鐘以沉淀之。細胞膜如第 11 步描述的那樣收集。
(2) 兩步分離方法
① 裂解后（第 9 步），900 g 離心 10 分鐘沉淀陽離子硅膠包被的細胞膜。沉淀將包栝硅膠包被的密度大的細胞膜片和細胞核，上清中包括內膜片和可溶性蛋白質。內膜可以用高速離心（50000 g) 來收集。
② 重懸沉淀于 4 ml 裂解緩沖液中并鋪于 70% 的 Nycodenz 溶液上。在吊桶式轉頭 ( 如 Beckman，SW60Ti) 中 28000 g 離心 30 分鐘。硅膠包被的細胞膜很容易經過 70% 的 Nycodenz 溶液而沉淀下來，并照第 11 步描述的那樣收集。
13. 小心去除所有上清以解收集管底沉積的硅膠包被的細胞膜。硅膠包被的細胞膜幾乎看不到，但加 1 ml 裂解緩沖液后就會明顯見到玻璃狀灰白色的沉淀。重懸沉淀于 1 ml 裂解緩沖液中。
14. 將重懸的硅膠包被的細胞膜轉移到 5 ml 錐形離心管中，至少三次用 1 ml 裂解緩沖液洗滌沉淀。如果下一步要確定蛋白質濃度，必須完全去掉 Nycodenz，Nyrodenz 強烈干擾幾種蛋白質濃度定量方法，包括 Lowry 法和雙縮脲法。這時分離的細胞膜可以用于要求非變性蛋白質的生化分析。
15. 在 2% SDS 溶液中煮沸硅膠包被的細胞膜 5 分鐘以溶解膜蛋白。如果煮沸之前先將沉淀均勻懸浮于含 2% SDS 的裂解緩沖液中并用超聲波簡短處理沉淀，每間隔 6 秒超聲 10 秒鐘，共超聲處理 5 次。會獲得最佳蛋白產量。
16. 用微型離心機高速離心 10 分鐘沉淀任何殘留的二氧化硅。
17. 取出上清，其中含有溶解的細胞膜蛋白，去掉二氧化硅沉淀。
展 |
|---|
