細胞自噬的研究方法介紹

正常培養的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調節，經報道的工具藥有：

一、自噬誘導劑

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激

(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

(3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

(5) Rapamycin：mTOR抑制劑

(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

二、自噬抑制劑

(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑

(2) Bafilomycin A1：質子泵抑制劑

(3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）

除了選用上述工具藥外，一般還需結合遺傳學技術對自噬相關基因進行干預：包括反義 RNA 干擾技術（Knockdown）、突變株篩選、外源基因導入等。

三、自噬過程進行觀察和檢測

細胞經誘導或抑制后，需對自噬過程進行觀察和檢測，常用的策略和技術有：

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。phagophore的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。

自噬溶酶體（AV2）的特征為：單層膜，胞漿成分已降解。（autophagic vacuole，AV）

2、在熒光顯微鏡下采用 GFP-LC3 融合蛋白來示蹤自噬形成

由于電鏡耗時長，不利于監測（Monitoring）自噬形成，人們利用 LC3 在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了此技術。無自噬時，GFP-LC3 融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3 融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。

3、利用 Western Blot 檢測 LC3-II/I 比值的變化以評價自噬形成

自噬形成時，胞漿型 LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉變為（自噬體）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I 比值的大小可估計自噬水平的高低。
（注意：LC3 抗體對 LC3-II 有更高的親和力，會造成假陽性。方法 2 和 3 需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。）

4、檢測長壽蛋白的批量降解：非特異

5、MDC（Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺）染色：包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

6、CellTrackerTM Green染色：主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

四、自噬相關蛋白的定位

在研究自噬相關蛋白時，需對其進行定位。由于自噬體與溶酶體、線粒體、內質網、高爾基體關系密切，為了區別，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：

Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用于監測自噬體與溶酶體融合。

LysoTrackerTM 探針：有紅或藍色可選，顯示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：載體，轉染后表達一個融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質定位信號），可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker 探針：特異性顯示活的線粒體，熒光在經過固定后還能保留。

Hsp60：定位與線粒體基質，細胞死亡時不會被釋放。

Calreticulin（鈣網織蛋白）：內質網腔

（注意：這些蛋白均為胞漿蛋白，爬片或胰酶消化的細胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize），可采用 0.1%SDS 處理。）

實驗案例 原代XXXX上皮細胞干預培養及MTT細胞增殖毒性檢測

實驗樣本：原代XXXX上皮細胞

實驗藥物：A藥物

刺激濃度：0.1％，0.01％，0.001％，0.000l％

時間點： 30 min、2 h、6 h、24 h

實驗方案：常規細胞傳代，用第 2～4 代細胞。傳代后孵育至少 24 h 至細胞 70％ 融合：細胞移入 96 孔板內，5×103 細胞/孔, 待細胞貼壁后，移去原培養液，加入含 0.1％，0.01％，0.001％ ，0.000l％ 共 4 個濃度的 A 藥物培養液。

在 30 min、2 h、6 h、24 h 共 4 個時間點時實驗終止，每孔加入 5 mg／mL 的 MTT 溶液 20uL，繼續孵育 4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加 DMSO(Dimethyl sulfoxide)150 uL，室溫下振蕩 10 min，立刻在酶聯免疫監測儀上測定各孔吸光度值 (選擇波長 490 nm)。

每濃度每時間點做 5 孔。設空白對照 1 孔 (不加細胞只加培養液), 最后比色以對照孔調零。實驗試劑：MTT（sigma）

操作步驟：在 96 孔板加入細胞 100μL/孔（約 5×103），置 37℃ 5%CO2 細胞培養箱培養 24 小時；

待細胞貼壁后，移去原培養液，加入含 0．1％，0．01％，0．001％ ，0．000 l％ 共 4 個濃度 A 藥物培養液；

在 30 min、2 h、6 h、24 h 共 4 個時間點時實驗終止；每孔加入 5 mg/ml 的 MTT 溶液 20ul，繼續孵育 4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液；每孔加 DMSO(Dimethyl sulfoxide)150 uL，室溫下振蕩 10 min，立刻在酶聯免疫監測儀上測定各孔吸光度值 (選擇波長 490 nm)。

實驗分組：

A 正常培養組

B 0.0001% A 藥物培養液
C 0.001% A 藥物培養液
D 0.01% A 藥物培養液
E 0.1% A 藥物培養液

結果分析：細胞存活率% =（加藥細胞 OD -本地 OD /對照細胞 OD-本地 OD）×100％

注：本底 OD 值（完全培養基加 MTT，無細胞）

30 min 時，490 nm 波長各孔的 OD 值

2h時，490 nm波長各孔的OD值

6h時，490 nm波長各孔的OD值