細胞熒光化學實驗

熒光法較一般光學方法具有靈敏度高、特異性強、方法簡便等優點，因此近年來熒光組織化學特別是免疫熒光技術有了很大的發展。利用熒光技術可研究細胞內化學成分的分布與定位，研究細胞與組織中物質的吸收與轉運，進行病理鑒別以及細胞免疫等方面的研究。 

當用一種波長的光(如紫外光)照射某種物質時，這種物質會在極短的時問內發射出較照射波長為長的光(可見的光)，這種光就稱為熒光。有些生物材料受到紫外線照射后能直接發出熒光稱自發熒光(或直接熒光)；有的生物材料受紫外線照射后并不發光，但當它吸收熒光染料后，也同樣產生熒光，稱間接熒光(或次生熒光)。與生物學有關的熒光現象有五種： 

1、 自發熒光 如葉綠索、維生素A的紅色熒光、膠原纖維的藍綠色熒光、脂褐素的藍色熒光等。

2、 誘發熒光 通過誘導劑作用而發的熒光，如甲醛蒸氣處理可誘發細胞和組織中生物單胺類(兒茶酚胺、5—羥色胺等)產生熒光。

3、熒光染料染色熒光 即經染色后熒光染料與細胞中某些成分結合而產生的熒光。

4、酶誘發熒光 通過細胞內酶的作用，使某些不發熒光的物質轉換為發熒光的產物。如細胞內的脂酶可使不發熒光的二醋酸熒光素分解為發熒光的熒光素。 
5、免疫熒光 熒光染料和抗體以共價鍵結合，這種標記的抗體再和相應的抗原形成抗原—抗體復合物，經激發后發射熒光，用以辨認抗原。
細胞和組織所產生的熒光必須通過熒光顯微鏡進行觀察或通過顯微熒光光度計進行定量測定。除少數生活物質含有自發熒光外，大多數研究需外加熒光染料，進行特異性結合而得以顯示。.

四．實驗方法
(一)幾種熒光染料對細胞染色的觀察 
細胞吖啶橙熒光染色的觀察 ：吖啶橙是zui經典的靈敏的熒光染料，它可對細胞中的DNA和RNA同時染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。
1．將生長有培養細胞的玻片或雞血涂片放入95%乙醇中固定15—30分鐘，干燥；
2．在1%醋酸中酸化30秒；
3．在標本片上滴加足量的0．01%吖啶橙磷酸緩沖染液，染色5-10分鐘；
4．用pH4．8磷酸緩沖液洗1分鐘；
5．0.1mol／L氯化鈣分化30秒或幾分鐘；
6．PBS漂洗三次，每次數秒鐘；
7．在干凈載玻片上滴—滴PBS，將標本片有細胞面向下臨時封固，或在血涂片上滴加磷酸緩沖液后加蓋玻片臨時封固；
8．在熒光顯微鏡下觀察，用藍紫光激發濾片，可見細胞核為綠色，細胞質為橙紅色，但常因細胞質的pH值的變化而呈棕色至鮮紅色。
(二)活細胞雙熒光染色觀察細胞核和線粒體 
一般的生物染料不能穿透細胞膜，只有當細胞被固定后改變了細胞膜的通透性，染料才能進入細胞內。但有些活體染料能進入活細胞，并對細胞不產生毒性作用。熒光染料Ho33342和若丹明123都是活體染料。Ho33342能與細胞中DNA進行特異的結合，若丹明123能與線粒體進行特異的結合。采用兩種熒光染料的混合染液可對一個活細胞的核和線粒體同時染色。
1. 用牙簽在自己口腔頰粘膜處刮取上皮細胞涂于干凈載玻片上；
2.滴一滴雙熒光染液(含0．25ug／mL Ho33342和若丹明123 1ug／mL的PBS液)于細胞上；
3.加上蓋玻片(注意防止氣泡)，用指甲油把蓋玻片邊緣封好；
4.用落射式熒光顯微經觀察。先用高倍鏡觀察細胞核(采用紫外光激發濾片／雙色束分離器／內裝阻斷濾片的組合插塊置于光路)，可見核發藍熒光。再換油鏡觀察線粒體(換用紫光或藍光的組合插塊)，在細胞核附近的胞質中可見有一些發綠光的圓形和短稈狀顆粒分布，即為線粒體。
五、熒光組化實驗中應注意的幾個問題
1．每種熒光染料，均有自己的zui適PH值，此時熒光zui強。當pH改變時，不僅熒光強度減弱，而且波長將有所改變，因此熒光檢測時要在一定的PH值的緩沖液中進行。
2．一放熒光染色在20。C以下時熒光比較穩定，溫度升高常出現溫度猝滅。
3．在熒光觀察中，常因激發光的增強而使樣品熒光很快衰竭，造成觀察和照相困難。為此用能量小的長波長光進行觀察，需照相時再適當增強激發光。
4．一般熒光染液的濃度在萬分之一以下，甚至億萬分之一，也能使標本著色。在一定的限度內，熒光強度可隨熒光素的濃度增加而增強，但超過限度，熒光強度反而下降，這是由于熒光分子間的締合而使自身熒光猝滅所致。